ਪੀਟਰ ਸਰਨੋ ਦੁਆਰਾ ਸੰਪਾਦਿਤ, ਸਟੈਨਫੋਰਡ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ ਸਕੂਲ ਆਫ਼ ਮੈਡੀਸਨ, ਸਟੈਨਫੋਰਡ ਯੂਨੀਵਰਸਿਟੀ, ਕੈਲੀਫੋਰਨੀਆ, 25 ਦਸੰਬਰ, 2020 ਨੂੰ ਮਨਜ਼ੂਰੀ ਦਿੱਤੀ ਗਈ (25 ਅਕਤੂਬਰ, 2020 ਨੂੰ ਸਮੀਖਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ)
ਅਸੀਂ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ-ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੰਪਲੈਕਸਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ ਸਬ-ਯੂਨਿਟਾਂ ਦੇ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਜੋ ਕਿ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਅਤੇ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਸੰਭਾਲ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹਨ।ਅਸੀਂ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਹਨ ਕਿ nsp12 ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸ ਵਿੱਚ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਮੋਨੋਫੋਸਫੇਟ (NMP) ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਨਿਸ਼ਾਨੇ ਵਜੋਂ nsp9 (ਇੱਕ RNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਹੈ।NiRAN ਇੱਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ nsp9 ਅਮੀਨੋ ਟਰਮਿਨਸ ਨਾਲ NMP ਮੋਈਏਟੀ ਦੇ ਸਹਿ-ਸੰਚਾਲਕ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜੋ Mn2+ ਆਇਨਾਂ ਅਤੇ ਆਸ ਪਾਸ ਦੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ Asn ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਕਿ NiRAN ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ nsp9 NMPylation ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹਨ।ਡੇਟਾ ਸਾਨੂੰ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਮਾਰਕਰ ਦੀ ਇਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਅਨੁਮਾਨ ਵਿੱਚ ਪਿਛਲੇ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਆਰਐਨਏ ਵਾਇਰਸਾਂ ਦੀ ਇੱਕ ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ ਆਰਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਅਤੇ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਕਸਾਰ ਹੈ।
ਨੀਡੋਵਾਇਰਲਜ਼ (ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰੀਡੇ, ਆਰਟੀਰੀਓਵਿਰਡੀਏ, ਅਤੇ 12 ਹੋਰ ਪਰਿਵਾਰ) ਦਾ ਆਰਐਨਏ-ਨਿਰਭਰ ਆਰਐਨਏ ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ (ਆਰਡੀਆਰਪੀਐਸ) ਪੌਲੀਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਜਾਰੀ ਗੈਰ-ਢਾਂਚਾਗਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (ਐਨਐਸਪੀ) ਵਿੱਚ ਐਮੀਨੋ-ਟਰਮੀਨਲ (ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ) ਡੋਮੇਨ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ, ਜਿਸਨੂੰ ਨੀਆਰਐਨ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। 1ab ਵਾਇਰਲ ਮੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ (Mpro) ਤੋਂ ਬਣਿਆ ਹੈ।ਪਹਿਲਾਂ, ਧਮਣੀਦਾਰ ਵਾਇਰਸ NiRAN-RdRp nsp ਦੀ ਆਪਣੀ GMPylation/UMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ (ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ ਅਣਜਾਣ) ਵਾਇਰਸ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਸੈੱਲ ਬਾਇਓਪੋਲੀਮਰਾਈਜ਼ੇਸ਼ਨ ਥਿੰਗਜ਼ ਵਿੱਚ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਮੋਨੋਫੋਸਫੇਟ (NMP) ਦੇ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਲਈ ਇੱਕ ਅਸਥਾਈ ਬਣਾਉਣ ਦਾ ਸੁਝਾਅ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਥੇ, ਅਸੀਂ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ (ਮਨੁੱਖੀ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ [HCoV] -229E ਅਤੇ ਗੰਭੀਰ ਤੀਬਰ ਸਾਹ ਲੈਣ ਵਾਲਾ ਸਿੰਡਰੋਮ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) ਵਿੱਚ Mn2+-ਨਿਰਭਰ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ Mpro-ਵਿਚੋਲੇ nsp9 ਦੇ ਗਠਨ ਦੁਆਰਾ nsp9 ਤੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। N-ਟਰਮੀਨਲ ਫਲੈਂਕਿੰਗ nsps ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਿਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜਾਰੀ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਫਾਸਫੋਰਾਮੀਡੇਟ ਨੂੰ nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ (N3825) ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਯੂਰੀਡੀਨ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ ਤਰਜੀਹੀ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਹੈ, ਪਰ ਐਡੀਨੋਸਿਨ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ, ਗੁਆਨੋਸਾਈਨ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ, ਅਤੇ ਸਾਈਟਿਡਾਈਨ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ ਵੀ ਢੁਕਵੇਂ ਸਹਿ-ਸਬਸਟਰੇਟ ਹਨ।ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ nsp9 ਅਤੇ nsp12 ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਅਤੇ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਜਨੀਅਰ ਕੀਤੇ HCoV-229E ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪਰਿਵਰਤਨ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ NiRAN-ਵਿਚੋਲੇ nsp9 NMPylation ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਸੱਭਿਆਚਾਰ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ।ਡੇਟਾ ਨੇ NiRAN ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਅਤੇ nsp9 NMPylation ਵਿੱਚ nsp9 N3826 ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਭੂਮਿਕਾ ਅਤੇ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ।ਇਹ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸੁਰੱਖਿਅਤ N-ਟਰਮੀਨਲ NNE ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਹੈ ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ nsp9 ਅਤੇ ਇਸਦੇ ਸਮਰੂਪਾਂ ਦੀ ਇੱਕੋ ਇੱਕ ਅਟੱਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸਾਬਤ ਹੋਈ ਹੈ।ਇਹ ਅਧਿਐਨ ਦੂਜੇ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਦੀ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਕਾਰਜਾਤਮਕ ਅਧਿਐਨ ਲਈ ਇੱਕ ਠੋਸ ਬੁਨਿਆਦ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ ਦਵਾਈਆਂ ਦੇ ਵਿਕਾਸ ਲਈ ਸੰਭਾਵਿਤ ਟੀਚਿਆਂ ਦਾ ਪ੍ਰਸਤਾਵ ਦਿੰਦਾ ਹੈ।
ਨਿਡੋਵਾਇਰਲਜ਼ ਸਕਾਰਾਤਮਕ-ਫਸੇ ਹੋਏ ਆਰਐਨਏ ਵਾਇਰਸ ਕਈ ਕਿਸਮ ਦੇ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਅਤੇ ਇਨਵਰਟੀਬ੍ਰੇਟ (1, 2) ਨੂੰ ਸੰਕਰਮਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਆਰਡਰ ਵਿੱਚ ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ 14 ਪਰਿਵਾਰ (3) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਪਿਛਲੇ 20 ਸਾਲਾਂ ਵਿੱਚ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰ ਦਾ ਵਿਆਪਕ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਉਸ ਸਮੇਂ, ਜਾਨਵਰਾਂ ਦੇ ਮੇਜ਼ਬਾਨਾਂ ਤੋਂ ਤਿੰਨ ਜ਼ੂਨੋਟਿਕ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਉੱਭਰ ਕੇ ਸਾਹਮਣੇ ਆਏ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖਾਂ ਵਿੱਚ ਗੰਭੀਰ ਸਾਹ ਦੀ ਲਾਗ ਦੇ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਫੈਲਣ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣੇ।ਗੰਭੀਰ ਗੰਭੀਰ ਛੂਤ ਦੀਆਂ ਬਿਮਾਰੀਆਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਲਗਾਤਾਰ ਮਹਾਂਮਾਰੀ ਵੀ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।ਸਾਹ ਲੈਣ ਵਾਲਾ ਸਿੰਡਰੋਮ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)।ਨਿਡੋਵਾਇਰਸ ਇੱਕ ਆਮ ਜੀਨੋਮ ਸੰਗਠਨ ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਅਤੇ ਝਿੱਲੀ-ਬਾਉਂਡ ਰਿਪਲੀਕੇਸ਼ਨ-ਟਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਕੰਪਲੈਕਸ (RTC) ਦਾ ਸਬਯੂਨਿਟ 5-?²-ਟਰਮੀਨਲ ਦੋ-ਤਿਹਾਈ ਅਤੇ ਵਾਇਰਸ ਕਣ ਦੇ ਮੁੱਖ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਸਬਯੂਨਿਟ ਵਿੱਚ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਨਾਲ ਹੀ ਕੁਝ ਸਹਾਇਕ ਉਪਕਰਣ .ਪ੍ਰੋਟੀਨ, ਜੀਨੋਮ (1) ਦੇ 3??² ਅੰਤ ਤੀਜੇ ਵਿੱਚ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਪਲੈਨਰੀਅਨ ਵਾਇਰਸ (ਮੋਨੋਵਿਰੀਡੇ) (8) ਦੇ ਇੱਕ ਪਰਿਵਾਰ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ, ਸਾਰੇ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸ ਦੋ ਵੱਡੇ ਓਪਨ ਰੀਡਿੰਗ ਫਰੇਮਾਂ (ORF) ORF1a ਅਤੇ ORF1b ਵਿੱਚ ਆਰਟੀਸੀ ਸਬਯੂਨਿਟਾਂ ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕਿ ਦੇ ਜੀਨੋਮਿਕ ਆਰਐਨਏ ਤੋਂ ਅਨੁਵਾਦ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ORF1a ਪੌਲੀਪ੍ਰੋਟੀਨ (pp) 1a ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ORF1a ਅਤੇ ORF1b ਸਾਂਝੇ ਤੌਰ 'ਤੇ pp1ab ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦਾ ਹੈ।ORF1a ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਮੁੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ (Mpro) ਦੀ ਆਮ ਭਾਗੀਦਾਰੀ ਦੇ ਨਾਲ, pp1a ਅਤੇ pp1ab ਦੋਵੇਂ ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਗੈਰ-ਢਾਂਚਾਗਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ (ਐਨਐਸਪੀਐਸ) ਵਿੱਚ ਸੰਸਾਧਿਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਜਿਸਨੂੰ 3CLpro ਵੀ ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਕਿਉਂਕਿ ਇਸ ਵਿੱਚ ਪਿਕੋਰਨਵਾਇਰਸ ਦੇ 3Cpro ਨਾਲ ਸਮਰੂਪਤਾ ਹੈ ( 9).ਇਹ nsps ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਗਤੀਸ਼ੀਲ RTC ਵਿੱਚ ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਬਾਰੇ ਸੋਚਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੀਨੋਮਿਕ RNA (ਰਿਪਲੀਕੇਸ਼ਨ) ਅਤੇ ਸਬਜੀਨੋਮਿਕ RNA (ਟਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ) ਦੇ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ORF1b (10??) ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਸਥਿਤ ORF ਦੇ ਸਮੀਕਰਨ ਨੂੰ ਤਾਲਮੇਲ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ? ?12)।
ਕੋਰ RTC ਵਿੱਚ RNA-ਨਿਰਭਰ RNA ਪੋਲੀਮੇਰੇਜ਼ (RdRp) (13), ਸੁਪਰਫੈਮਲੀ 1 ਹੈਲੀਕੇਸ (HEL1) (14, 15) ਅਤੇ ਕਈ RNA ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਜੋ ਮੁੱਖ ਤੌਰ 'ਤੇ ORF1b ਵਿੱਚ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹਨ ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ nsp12-nsp16 ਅਤੇ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। nsp9-nsp12 Arterioviridae ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ (ਹਵਾਲਾ 10ââ 12 ਦੇਖੋ)।RdRp ਅਤੇ HEL1 ਪੰਛੀਆਂ ਦੇ ਆਲ੍ਹਣੇ ਦੇ ਵਾਇਰਸ ਦੇ ਦੋ (ਇੱਕ-ਪੰਜਵੇਂ) ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਡੋਮੇਨਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਦੂਜੇ ਆਰਐਨਏ ਵਾਇਰਸਾਂ ਵਿੱਚ ਸਮਰੂਪਤਾ ਰੱਖਦੇ ਹਨ।ਕੋਰ ਰੀਪਲੀਕੇਸ ਨੂੰ ਹੋਰ ਸਬ-ਯੂਨਿਟਾਂ ਦੁਆਰਾ ਸਹਾਇਤਾ ਪ੍ਰਾਪਤ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ pp1a ਦੇ ਕਾਰਬਾਕਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ (C-ਟਰਮੀਨਲ) ਖੇਤਰ ਤੋਂ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਗਏ ਕਈ ਛੋਟੇ nsps, Mpro ਦੀ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ (ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ nsp5 ਅਤੇ ਧਮਣੀ ਵਾਇਰਸ nsp4, ਕ੍ਰਮਵਾਰ) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਉਹਨਾਂ ਕੋਲ ਸੀਮਤ ਪਰਿਵਾਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸੁਰੱਖਿਆ ਅਤੇ ਵਿਭਿੰਨ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਹਨ (ਸਵਾਲ 10ââ12 ਵਿੱਚ ਸਮੀਖਿਆ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ)।
ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ, ਸਾਰੇ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਵਿੱਚ RdRp ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ ਐਮੀਨੋ ਟਰਮੀਨਸ (N-ਟਰਮਿਨਸ) 'ਤੇ ਵਿਲੱਖਣ ਕ੍ਰਮ ਮੋਟਿਫ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵਾਲਾ ਇੱਕ ਡੋਮੇਨ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਰ ਕੋਈ ਹੋਰ RNA ਵਾਇਰਸ ਨਹੀਂ (16)।ਇਸਦੇ ਸਥਾਨ ਅਤੇ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ (ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਮੋਨੋਫੋਸਫੇਟ [NMP] ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ) ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਆਧਾਰ 'ਤੇ, ਇਸ ਡੋਮੇਨ ਦਾ ਨਾਮ NiRAN (Nestvirus RdRp-ਸਬੰਧਤ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ) ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।NiRAN-RdRp ਦਾ ਦੋਹਰਾ-ਡੋਮੇਨ ਸੁਮੇਲ Coronaviridae ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ nsp12 ਅਤੇ Arterioviridae ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ nsp9 ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਹੋਰ nestoviridae ਵਿੱਚ, NiRAN-RdRp ਨੂੰ ਵਾਇਰਲ ਪੌਲੀਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤੋਂ ਇੱਕ ਸੁਤੰਤਰ ਐੱਨਐੱਸਪੀ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜਾਰੀ ਕੀਤੇ ਜਾਣ ਦੀ ਉਮੀਦ ਹੈ।ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਵਿੱਚ, NiRAN ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ 1/450 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਅਤੇ ਲਿੰਕਰ ਖੇਤਰ (16?19) ਦੁਆਰਾ C-ਟਰਮੀਨਲ RdRp ਡੋਮੇਨ ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) ਵਿੱਚ, ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ nsp9 Mn2+ ਆਇਨ-ਨਿਰਭਰ (ਸਵੈ) UMPylation ਅਤੇ GMPylation ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਨੈਸਟੋਵਾਇਰਸ, AN, BN ਅਤੇ CN ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕ੍ਰਮ ਆਧਾਰਾਂ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ।ਜਿੱਥੇ N ਦਾ ਅਰਥ ਹੈ NiRAN) (16)।ਇਹਨਾਂ ਮੋਟਿਫਾਂ ਦਾ N-ਟਰਮੀਨਲ ਫਲੈਂਕਿੰਗ ਇੱਕ ਘੱਟ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਮੋਟਿਫ preAN ਹੈ।ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੁਝ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੂਰ-ਸੰਬੰਧਿਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨਾਸਿਸ ਵਿੱਚ ਵੀ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹਨ, ਜਿੱਥੇ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ ਨਿਊਕਲੀਓਸਾਈਡ ਟ੍ਰਾਈਫੋਸਫੇਟ (NTP) ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਗਤੀਵਿਧੀ (20, 21) ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਨਿਰੀਖਣ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, ਸੂਡੋਮੋਨਸ ਸਰਿੰਗੇ ਤੋਂ ਸੂਡੋਕਿਨੇਜ਼ ਸੇਲੋ ਵਿਚ ਕਈ ਮੁੱਖ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿਚ ਪ੍ਰਕਾਸ਼ਿਤ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ਸੁਪਰਕੰਪਲੈਕਸ ਨਾਲ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਲੈਕਟ੍ਰੌਨ ਮਾਈਕਰੋਸਟ੍ਰਕਚਰ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕਰੋਨਾਵਾਇਰਸ NiRAN ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (17).ਇਹ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਦਸਤਾਵੇਜ਼ੀ (ਸਵੈ) U/GMPylation NMP ਨੂੰ (ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ ਅਣਜਾਣ) ਸਬਸਟਰੇਟ (16) ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਨ ਲਈ ਇੱਕ ਅਸਥਾਈ ਸਥਿਤੀ ਪੈਦਾ ਕਰੇਗਾ, ਅਤੇ NiRAN ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨੇਜ਼ (17, 19) ਵਿਚਕਾਰ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾ (17, 19)) ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਹੈ। NiRAN ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਸੋਧਦਾ ਹੈ।
ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਨਾਲ ਇਸਦੀ ਵਿਲੱਖਣ ਅਤੇ ਵਿਲੱਖਣ ਯੋਜਨਾਬੱਧ ਸਬੰਧ ਅਤੇ RdRp ਤੋਂ ਜੈਨੇਟਿਕ ਵਿਛੋੜੇ ਸਮੇਤ ਬਹੁਤ ਸਾਰੀਆਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ, ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਲਈ ਨੀਰਾਨ ਨੂੰ ਇੱਕ ਵਾਜਬ ਮੁੱਖ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਬਣਾਉਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਉਭਰਨ ਅਤੇ ਪਛਾਣ ਲਈ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਹੈ।ਪਹਿਲਾਂ, ਜੀਨੋਮ/ਸਬਜੀਨੋਮਿਕ ਟ੍ਰਾਂਸਲੇਸ਼ਨ ਜਾਂ ਰੀਪਲੀਕੇਸ਼ਨ/ਟਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ NiRAN ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਤਿੰਨ ਸੰਭਾਵੀ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਨੂੰ ਬੁਲਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਸੀ।ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਉਪਲਬਧ ਦੁਰਲੱਭ ਅਤੇ ਅਧੂਰੇ ਡੇਟਾ ਨੂੰ ਵਿਚਾਰਦੇ ਹੋਏ, ਹਰੇਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੇ ਆਪਣੇ ਫਾਇਦੇ ਅਤੇ ਨੁਕਸਾਨ ਹਨ (16)।ਇਸ ਖੋਜ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਦੋ ਪੀੜ੍ਹੀਆਂ ਦੀ ਨੁਮਾਇੰਦਗੀ ਕਰਨ ਵਾਲੇ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦੇ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਜੈਨੇਟਿਕ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਦਾ ਟੀਚਾ ਰੱਖਦੇ ਹਾਂ, ਅਤੇ ਸਾਡੀਆਂ ਖੋਜਾਂ ਨੂੰ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰ ਦੇ ਕੁਦਰਤੀ ਪਰਿਵਰਤਨ ਦੇ ਵਿਕਾਸਵਾਦੀ ਪਿਛੋਕੜ ਵਿੱਚ ਰੱਖਣਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਇਸ ਰਹੱਸਮਈ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸਮਝ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕੇ।ਅਸੀਂ RTC ਵਿੱਚ ਕੁਦਰਤੀ ਟੀਚਿਆਂ ਦੀ ਪਛਾਣ ਦੁਆਰਾ NiRAN ਦੀ ਸਮਝ ਵਿੱਚ ਵੱਡੀਆਂ ਤਰੱਕੀਆਂ ਦੀ ਰਿਪੋਰਟ ਕਰਦੇ ਹਾਂ, ਜੋ (ਤਿੰਨ ਉਪਲਬਧ ਅਨੁਮਾਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ) ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸ RNA ਦੇ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਨੂੰ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਇਸ ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ ਵਿੱਚ ਯੋਗਦਾਨ ਪਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਖੋਜ ਵਾਇਰਸ ਹੋਸਟ ਇੰਟਰਫੇਸ 'ਤੇ NiRAN ਦੀਆਂ ਹੋਰ ਭੂਮਿਕਾਵਾਂ ਲਈ ਸੰਭਾਵਨਾਵਾਂ ਵੀ ਖੋਲ੍ਹਦੀ ਹੈ।
ਕੋਰੋਨਾ ਵਾਇਰਸ nsp12-ਸਬੰਧਤ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੀਆਂ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਈ. ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ ਮਨੁੱਖੀ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ 229E (HCoV-229E) nsp12 ਦਾ ਇੱਕ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ ਰੂਪ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ C-ਟਰਮਿਨਸ ਵਿੱਚ His6 ਟੈਗ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸ ਨੂੰ ਜੋੜਿਆ। [α32-P] ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ MnCl2 ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ NTP ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲ ਕੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਢੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਉਤਪਾਦ ਦੇ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ nsp12 (106 kDa) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਰੇਡੀਓਲੇਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਹਿ-ਪ੍ਰਵਾਸ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਸੰਕੇਤ ਦਿੱਤਾ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ nsp12 ਕੋਵੈਲੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-NMP ਐਡਕਟਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ ਯੂਰੀਡੀਨ ਮੋਨੋਫੋਸਫੇਟ (ਯੂਐਮਪੀ) (ਐਂਡੀਏ) ਨਾਲ ਬਣਿਆ ਹੈ। ਬੀ).ਮਾਤਰਾਤਮਕ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਦੂਜੇ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡਸ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, UMP ਸੰਮਿਲਨ ਦੀ ਸਿਗਨਲ ਤੀਬਰਤਾ 2 ਤੋਂ 3 ਗੁਣਾ ਵਧ ਗਈ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 1C).ਇਹ ਡੇਟਾ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ (16) ਦੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਪੂਰਵ-ਅਨੁਮਾਨਿਤ NMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ, ਪਰ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਅਤੇ ਧਮਣੀ ਵਾਇਰਸ ਦੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੀਆਂ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਤਰਜੀਹਾਂ ਵੱਖਰੀਆਂ ਹਨ।
HCoV-229E nsp12 ਦੀ ਸਵੈ-NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ।(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ਨੂੰ 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 6 mM MnCl2 ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਮਨੋਨੀਤ [α-32P] NTP ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਵੇਰਵਿਆਂ ਲਈ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਢੰਗ ਵੇਖੋ)।ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ Coomassie ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਨੀਲੇ ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।(ਬੀ) ਰੇਡੀਓਲੇਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਫਾਸਫੋਰਸ ਇਮੇਜਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਕਲਪਨਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।nsp12-His6 ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਅਣੂ ਮਾਸ ਮਾਰਕਰ (ਕਿਲੋਡਾਲਟਨ ਵਿੱਚ) ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ A ਅਤੇ B ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈਆਂ ਗਈਆਂ ਹਨ। (C) ਰੇਡੀਓਐਕਟਿਵ ਸਿਗਨਲ (ਮਤਲਬ ± SEM) ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।*P≤0.05.ਸਿਗਨਲ ਤਾਕਤ (ਪ੍ਰਤੀਸ਼ਤ) UTP ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਹੈ।
ਹਾਲਾਂਕਿ NiRAN-ਸਬੰਧਤ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ (16) ਵਿੱਚ EAV ਅਤੇ SARS-CoV ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਖਾਸ NiRAN ਫੰਕਸ਼ਨ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵੀ ਟੀਚਿਆਂ ਨੂੰ ਅਜੇ ਤੱਕ ਨਿਰਧਾਰਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਨੀਰਾਨ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨੇਜ਼-ਵਰਗੇ ਫੋਲਡ (17, 22) ਦੇ ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਪਰਿਵਾਰ ਵਿਚਕਾਰ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਇਸ ਧਾਰਨਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਪ੍ਰੇਰਿਆ ਕਿ NiRAN ਦੂਜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੇ NMPylation ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਅਸੀਂ HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਗੈਰ-ਢਾਂਚਾਗਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੇਤ ਸੰਭਾਵੀ ਸਮਰੂਪ ਟੀਚਿਆਂ ਦਾ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਹੈ, ਹਰੇਕ ਵਿੱਚ ਇੱਕ C-ਟਰਮੀਨਲ His6 ਟੈਗ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1) ਹੈ, ਅਤੇ nsp12 ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਨੂੰ [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) ਨਾਲ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ।ਬੋਵਾਈਨ ਸੀਰਮ ਐਲਬਿਊਮਿਨ ਅਤੇ ਈ. ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੋਏ MBP-LacZα ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕੀਤਾ (ਚਿੱਤਰ 2A, ਲੇਨ 1 ਤੋਂ 7)।ਸੋਡੀਅਮ ਡੋਡੇਸਾਈਲ ਸਲਫੇਟ-ਪੋਲੀਐਕਰੀਲਾਮਾਈਡ ਜੈੱਲ ਇਲੈਕਟੋਫੋਰੇਸਿਸ (SDS-PAGE) ਅਤੇ ਆਟੋਰੇਡੀਓਗ੍ਰਾਫੀ ਦੁਆਰਾ ਰੇਡੀਓਲਾਬੇਲਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਇਹ ਪਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਕਿ nsp12 ਅਤੇ nsp9 ਵਾਲੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਜ਼ਬੂਤ ਰੇਡੀਓਐਕਟਿਵ ਸਿਗਨਲ ਸੀ।ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਸਥਿਤੀ nsp9 ਦੇ ਅਣੂ ਪੁੰਜ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ nsp9 (ਚਿੱਤਰ 2B, ਟਰੈਕ 7) ਦੇ nsp12-ਵਿਚੋਲੇ UMPylation ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।ਕੋਈ ਹੋਰ ਟੈਸਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ UMPylated ਨਹੀਂ ਪਾਇਆ ਗਿਆ, ਜਿਸ ਨਾਲ ਅਸੀਂ ਇਹ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਿਆ ਕਿ nsp9 nsp12 ਦਾ ਇੱਕ ਖਾਸ ਸਬਸਟਰੇਟ ਹੈ।ਚਿੱਤਰ 1 ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਸਵੈ-NMPylation ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, nsp12 ਸਾਰੇ ਚਾਰ NMPs ਨੂੰ nsp9 ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਵੱਖਰੀ ਹੈ, UMP> ਐਡੀਨੋਸਾਈਨ ਮੋਨੋਫੋਸਫੇਟ (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ਤਸਵੀਰ).3 ਏ ਅਤੇ ਬੀ)ਇਸ ਪਰਖ ਵਿੱਚ ਵਰਤੀਆਂ ਗਈਆਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਦੇ ਤਹਿਤ (ਪ੍ਰਤੀਕਰਮ ਅਤੇ ਐਕਸਪੋਜਰ ਦੇ ਸਮੇਂ ਨੂੰ ਛੋਟਾ ਕਰੋ, nsp12 ਦੀ ਤਵੱਜੋ ਨੂੰ ਘਟਾਓ; ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਵਿਧੀਆਂ), nsp12 ਦੇ ਸਵੈ-NMPylation ਦਾ ਪਤਾ ਨਹੀਂ ਲਗਾਇਆ ਜਾ ਸਕਿਆ (ਚਿੱਤਰ 2B, ਲੇਨ 7, ਅਤੇ ਚਿੱਤਰ 1B ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਕਰੋ), ਜੋ ਇੱਕ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਸਾਬਤ ਹੋਇਆ (ਅਤੇ ਮਲਟੀਪਲ ਰਾਊਂਡ) UMP nsp12 ਤੋਂ nsp9 ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਹੋ ਗਿਆ।UMP ਟਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਲਈ Mn2+ ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 3C ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ Mg2+ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਸਿਰਫ ਘੱਟੋ-ਘੱਟ UMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇਖੀ ਗਈ ਸੀ, ਅਤੇ ਟੈਸਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਹੋਰ ਦੋ ਡਾਇਵਲੈਂਟ ਕੈਸ਼ਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਕੋਈ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦਾ ਡੇਟਾ NMPylation ਅਸੈਸਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਸ ਵਿੱਚ cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), ਅਤੇ ਐਡੀਨੋਸਿਨ ਟ੍ਰਾਈਫਾਸਫੇਟ (ATP) (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S1) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।
nsp9 ਦਾ HCoV-229E nsp12-ਵਿਚੋਲਾ UMPylation.ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਬਸਟਰੇਟਸ ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ (ਬੋਵਾਈਨ ਸੀਰਮ ਐਲਬਿਊਮਿਨ, MBP-lacZα, ਅਤੇ ORF1a ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ C-ਟਰਮੀਨਲ His6 ਨਾਲ ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ HCoV-229E nsps ਦੀ ਇੱਕ ਲੜੀ ਸਮੇਤ) ਨੂੰ HCoV-229E nsp12-Histed⁺ ਦੀ UMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। ਪ੍ਰੋਟੀਨਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਤਰੀਕਿਆਂ ਵਿੱਚ ਵਰਣਨ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ nsp12 ਦੀ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ (A) ਜਾਂ ਮੌਜੂਦਗੀ (B) ਵਿੱਚ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ [α-32P] UTP ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰੋ।A ਅਤੇ B ਦੇ ਸਿਖਰ 'ਤੇ, ਕੂਮੈਸੀ ਬ੍ਰਿਲਿਅੰਟ ਬਲੂ ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਐਸਡੀਐਸ-ਪੌਲੀਕ੍ਰੀਲਾਮਾਈਡ ਜੈੱਲ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਏ ਅਤੇ ਬੀ ਦੇ ਹੇਠਾਂ, ਅਨੁਸਾਰੀ ਆਟੋਰੇਡੀਓਗਰਾਮ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਹਨ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਅਣੂ ਪੁੰਜ ਮਾਰਕਰ (ਕਿਲੋਡਾਲਟਨ ਵਿੱਚ) ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਖੱਬੇ ਪਾਸੇ ਦਿੱਤੀ ਗਈ ਹੈ।nsp12-His6 (B, top) ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਅਤੇ nsp9-His6 (B, ਲੇਨ 7) ਦੇ ਨਾਲ nsp12-His6 ਦੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਹੋਣ ਦੇ ਦੌਰਾਨ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਰੇਡੀਓਐਕਟਿਵ ਸਿਗਨਲ ਵੀ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ [α-32P] UMP ਤੋਂ nsp9-His6 (12.9 kDa), ਜੋ ਕਿ ਦੂਜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਜਾਂਚ ਲਈ ਨਹੀਂ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
HCoV-229E NiRAN-ਵਿਚੋਲੇ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਅਤੇ nsp9 NMPylation ਦੀ ਵਾਇਰੋਲੋਜੀਕਲ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ।(A ਅਤੇ B) ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕੋ-ਸਬਸਟਰੇਟ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ।Nsp12-His6 ਅਤੇ nsp9-His6 ਨੂੰ ਮਿਆਰੀ NMPylation ਪਰਖ ਵਿੱਚ ਵੱਖ-ਵੱਖ [α-32P] NTPs ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਮਿਲਾਇਆ ਅਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।(A, ਸਿਖਰ) Coomassie-stained nsp9-His6 SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।(ਏ, ਥੱਲੇ) ਜੈੱਲ ਦੇ ਉਸੇ ਖੇਤਰ ਦਾ ਆਟੋਰੇਡੀਓਗ੍ਰਾਫ.(ਬੀ) ਮਨੋਨੀਤ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕੋਫੈਕਟਰ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਰਿਸ਼ਤੇਦਾਰ ਗਤੀਵਿਧੀ (ਮਤਲਬ ± SEM) ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ।*P≤0.05.(C) ਧਾਤੂ ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ।[α-32P] UTP ਅਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਧਾਤੂ ਆਇਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਮਿਆਰੀ NMPylation ਟੈਸਟ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਹਰ ਇੱਕ 1 mM ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਨਾਲ।C ਵਿੱਚ, ਉੱਪਰ, Coomassie stained nsp9-His6 ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ C ਵਿੱਚ, ਹੇਠਾਂ, ਅਨੁਸਾਰੀ ਆਟੋਰੇਡੀਓਗ੍ਰਾਫੀ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਆਕਾਰ (ਕਿਲੋਡਾਲਟਨ ਵਿੱਚ) A ਅਤੇ C ਦੇ ਖੱਬੇ ਪਾਸੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ। (D) HCoV-229E nsp12-His6 ਦਾ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਰੂਪ ਨਿਰਧਾਰਤ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਬਦਲ ਨੂੰ ਲੈ ਕੇ [α-32P]UTP ਵਿੱਚ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਢੰਗ ਵਿੱਚ.NMPylation ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੋਏ radiolabled nsp9-His6 ਨੂੰ ਫਾਸਫੋਰਿਲੇਸ਼ਨ ਇਮੇਜਿੰਗ (D, top) ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ (wt) ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਨਾਲ ਤੁਲਨਾਤਮਕ ਗਤੀਵਿਧੀ D ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ, ਅਤੇ ਹੇਠਲੇ ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਔਸਤ (±SEM) ਵਜੋਂ ਲਿਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਤਾਰੇ ਗੈਰ-ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਬਦਲ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।(ਈ) ਪੀ 1 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ ਕਲਚਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਟਾਈਟਰ ਸੰਕਰਮਣ ਦੇ 24 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜੋ ਪਲੇਕ ਪਰਖ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੰਜਨੀਅਰਡ HCoV-229E ਮਿਊਟੈਂਟ ਦੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਕੋਡੋਨ ਬਦਲ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਹਨ (ਰਹਿੰਦੀ ਸੰਖਿਆ pp1ab ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ)।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ-ਘਾਟ RdRp ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਮਿਊਟੈਂਟ nsp12_DD4823/4AA ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
NiRAN ਦੀ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਦੀ ਡੂੰਘੀ ਸਮਝ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਅਤੇ nsp9-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ NMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨਾਲ ਸੰਬੰਧਿਤ ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਪਰਿਵਰਤਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਅਸੀਂ NiRAN AN, BN ਅਤੇ CN ਮੋਟਿਫਾਂ ਵਿੱਚ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ( 16) ਇਹ ਅਲਾ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S2) ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਰੂੜੀਵਾਦੀ Arg-to-Lys ਜਾਂ Lys-to-Arg ਬਦਲ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਦੋ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ (ਨਕਾਰਾਤਮਕ) ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਅਵਸ਼ੇਸ਼ ਜੋ ਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਅਤੇ ਹੋਰ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਦੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਨਹੀਂ ਹਨ ਜਾਂ ਘੱਟ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਨਹੀਂ ਹਨ ਨੂੰ Ala ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ। K4116A (ਮੋਟਿਫ preAN ਵਿੱਚ), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (ਮੋਟਿਵ BN) ਅਤੇ D4280A (CN) nsp12 ਦੁਆਰਾ nsp9 NMPylation ਨੂੰ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਇੱਥੋਂ ਤੱਕ ਕਿ ਖ਼ਤਮ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਰੂੜ੍ਹੀਵਾਦੀ ਬਦਲ (R4178K), K4116R) ਨਾਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਆਪਣੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ 60% ਅਤੇ 80% ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਪਾਸੇ ਦੀਆਂ ਪਾਬੰਦੀਆਂ ਦੀ ਢਿੱਲ। ਚੇਨਜ਼ ਭੌਤਿਕ ਰਸਾਇਣਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਵੇਦਨਸ਼ੀਲ ਹਨ (ਚਿੱਤਰ 3D)।ਕਈ ਹੋਰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ E4145A, D4273A, F4281A ਅਤੇ D4283A ਨੂੰ ਬਦਲਣਾ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਨੁਕਸਾਨਦੇਹ ਹੈ, ਅਤੇ nsp9 UMPylation ਸਿਰਫ ਮੱਧਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜੇ nsp9 NMPylation ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਹੋਰ NTPs (ਚਿੱਤਰ 3D ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3) ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਇਸ ਗੱਲ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਖਾਸ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਬਦਲਵਾਂ 'ਤੇ ਦੇਖੇ ਗਏ ਪ੍ਰਭਾਵ ਵਰਤੇ ਗਏ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਕੋ-ਸਬਸਟਰੇਟ ਦੀ ਕਿਸਮ ਤੋਂ ਸੁਤੰਤਰ ਹਨ।ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ 'ਤੇ ਇਨ੍ਹਾਂ nsp12 ਬਦਲਾਵਾਂ ਦੇ ਸੰਭਾਵੀ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕੀਤੀ।ਇਸ ਲਈ, ਅਸੀਂ 5 -7 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਾਈਬ ਕਰਨ ਲਈ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਵੈਕਸੀਨਿਆ ਵਾਇਰਸ (23, 24) ਵਿੱਚ ਕਲੋਨ ਕੀਤੇ ਉਚਿਤ ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਜਨੀਅਰਡ ਪੂਰਕ ਡੀਐਨਏ (cDNA) ਟੈਂਪਲੇਟਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਇਹਨਾਂ ਸੈੱਲਾਂ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੋਏ ਛੂਤ ਵਾਲੇ ਵਾਇਰਸ ਦੀ ਸੰਤਾਨ ਦੇ ਸਿਰਲੇਖ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ HCoV-229E NiRAN ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਨਹੀਂ ਸਨ (ਚਿੱਤਰ 3E)।ਗੈਰ-ਵਿਹਾਰਕ ਵਾਇਰਲ ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਦੇ ਇੱਕ ਸਮੂਹ ਵਿੱਚ ਉਹ ਵਿਕਲਪ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਵਿਟਰੋ (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A) ਵਿੱਚ NMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਜਾਂ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਉਣ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਪਰ ਦੋ ਹੋਰ ਵਿਕਲਪ ਹਨ (K4116R, E4145A) % ਰਾਖਵਾਂ?ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਇਨ ਵਿਟਰੋ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦੀ ਹੈ ਕਿ ਵਾਧੂ ਪਾਬੰਦੀਆਂ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਦੋ ਹੋਰ ਪਰਿਵਰਤਨ (R4178K, F4281A) ਜੋ ਕਿ NiRAN ਦੀ ਇਨ ਵਿਟਰੋ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਕਮੀ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੇ ਹਨ, ਨੇ ਲਾਈਵ ਵਾਇਰਸ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ, ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹਨਾਂ ਵਾਇਰਸਾਂ ਨੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਦੁਆਰਾ ਟਾਈਟਰਾਂ ਨੂੰ ਕਾਫ਼ੀ ਘਟਾਇਆ।ਚਿੱਤਰ 3D ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਏ ਗਏ ਇਨ-ਵਿਟਰੋ ਗਤੀਵਿਧੀ ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, ਚਾਰ ਹੋਰ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਬਦਲਣਾ ਜੋ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਹੋਰ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਨਹੀਂ ਹਨ (8, 16) ਨੇ ਵਿਵਹਾਰਕ ਵਾਇਰਸ ਪੈਦਾ ਕੀਤੇ, ਹੋਣ ਦੇ ਬਾਵਜੂਦ ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ ਦੇ ਵਾਇਰਸ (ਚਿੱਤਰ 3E) ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਘਟਾਇਆ ਗਿਆ ਟਾਈਟਰ।
ਇਹ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ ਕਿ ਕੀ NiRAN-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੀ NMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਸਰਗਰਮ RdRp ਡੋਮੇਨ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ, RdRp ਮੋਟਿਫ C ਵਿੱਚ divalent ਧਾਤੂ ਆਇਨਾਂ (11) ਦੇ ਤਾਲਮੇਲ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਦੋ ਸੁਰੱਖਿਅਤ Asp ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ Ala ਦੁਆਰਾ ਬਦਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ। ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨ nsp12_DD4823/4AA ਬਰਕਰਾਰ ਰਹਿੰਦਾ ਹੈ। ਇਸਦੀ nsp9 NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ nsp12-ਵਿਟਰੋ nsp9 NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ ਲੋੜ ਨਹੀਂ ਹੈ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S4)।
nsp12 ਲਈ nsp9-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ NMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਸਥਾਪਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਅਸੀਂ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (MS) ਦੁਆਰਾ NMP-nsp9 ਐਡਕਟ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕੀਤੀ।ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ HCoV-229E nsp9 ਦੇ ਪੂਰੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਨੇ 12,045 Da (ਚਿੱਤਰ 4A) 'ਤੇ ਸਿਖਰ ਦਿਖਾਇਆ।nsp12 ਨੂੰ ਜੋੜਨ ਨਾਲ nsp9 ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ ਨਹੀਂ ਬਦਲੀ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ nsp12 ਅਤੇ nsp9 ਵਰਤੀਆਂ ਜਾਣ ਵਾਲੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ (ਡਿਨੈਚੁਰੇਸ਼ਨ) (ਚਿੱਤਰ 4A) ਦੇ ਅਧੀਨ ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨਹੀਂ ਬਣਾਉਣਗੇ।UTP ਅਤੇ GTP ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ nsp9 ਅਤੇ nsp12 ਵਾਲੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਪੁੰਜ ਮਾਪ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ UTP ਦਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੁੰਜ 306 Da ਹਿਲਾ ਗਿਆ, ਅਤੇ GTP ਦਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੁੰਜ 345 Da ਹਿਲਾ ਗਿਆ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਹਰੇਕ nsp9 ਅਣੂ ਇੱਕ UMP ਜਾਂ GMP ਨੂੰ ਬੰਨ੍ਹਦਾ ਹੈ। (ਤਸਵੀਰ 4) ਸੀ ਅਤੇ ਡੀ).ਇਹ ਅੰਦਾਜ਼ਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ NiRAN-ਵਿਚੋਲੇ nsp9 NMPylation ਲਈ ਲੋੜੀਂਦੀ ਊਰਜਾ NTP ਹਾਈਡੋਲਿਸਿਸ ਅਤੇ ਪਾਈਰੋਫੋਸਫੇਟ ਰੀਲੀਜ਼ ਤੋਂ ਆਉਂਦੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਇਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ nsp12 (ਐਨਜ਼ਾਈਮ) ਨਾਲੋਂ nsp9 (ਟਾਰਗੇਟ) ਦੀ 10-ਗੁਣਾ ਮੋਲਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, nsp9 ਦਾ ਲਗਭਗ ਪੂਰਾ NMPylation ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ nsp12 ਅਤੇ nsp9 ਵਿਚਕਾਰ ਆਪਸੀ ਤਾਲਮੇਲ ਥੋੜ੍ਹੇ ਸਮੇਂ ਲਈ ਹੈ, ਅਤੇ nsp12 ਹੋਰ nsp9 ਨੂੰ NMPylate ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਵਿਟਰੋ ਅਣੂ ਵਿੱਚ.
nsp12 ਅਤੇ UTP ਜਾਂ GTP ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ nsp9 ਦਾ ਸਿੰਗਲ NMPylation.ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ HCoV-229E nsp9 (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1) (AD) ਦਾ ਡੀਕਨਵੋਲਿਊਟਿਡ ਪੂਰਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ।(A) nsp9 ਇਕੱਲੇ, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ।
nsp12 ਦੁਆਰਾ UMPylated nsp9 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, nsp9-UMP ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ ਨਾਲ ਕਲੀਵ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪੈਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਨੈਨੋ-ਹਾਈ ਪਰਫਾਰਮੈਂਸ ਲਿਕਵਿਡ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (HPLC) ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਟੈਂਡਮ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟ੍ਰੋਮੈਟਰੀ (MS/MS) ਦੁਆਰਾ ਔਨਲਾਈਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਬਾਇਓਨਿਕ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਪੈਕੇਜ (ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਮੈਟ੍ਰਿਕਸ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਡੇਟਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਅਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਦਾ UMPylation ਦਿਖਾਇਆ।ਇਹ ਦਸਤੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਹੈ.ਪੂਰਵਦਰਸ਼ਕ ਪੇਪਟਾਇਡ [UMP]NNEIMPGK (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S5A) ਦੇ ਟੈਂਡਮ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਨੇ 421 m/z 'ਤੇ ਇੱਕ ਟੁਕੜਾ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ UMP nsp9 ਦੇ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 1 ਨਾਲ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।
nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ, Asn ਨੂੰ Orthocoronavirinae (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S6) ਦੇ ਮੈਂਬਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਅਸੀਂ ਮੰਨਦੇ ਹਾਂ ਕਿ N-ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ ਨਾਈਟ੍ਰੋਜਨ UMP ਲਈ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੰਭਾਵਿਤ ਸਵੀਕਾਰਕਰਤਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ N-ਟਰਮੀਨਲ 'ਤੇ NMP ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੇ ਵਾਧੂ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਦਾ ਫੈਸਲਾ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਇਸ ਕਾਰਨ ਕਰਕੇ, HPLC ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਗੈਰ-NMPylated ਅਤੇ NMPylated N-ਟਰਮੀਨਲ ਪੇਪਟਾਇਡ nsp9 ਐਸੀਟੋਨ ਅਤੇ ਸੋਡੀਅਮ ਸਾਈਨੋਬੋਰੋਹਾਈਡਰਾਈਡ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹਨਾਂ ਸ਼ਰਤਾਂ ਦੇ ਤਹਿਤ, ਪ੍ਰੋਪੀਲ (25) ਨਾਲ ਕੇਵਲ ਮੁਫਤ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ ਨੂੰ ਸੋਧਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਕ੍ਰਮ NNEIMPGK ਦੇ ਨਾਲ N-ਟਰਮੀਨਲ nsp9-ਪ੍ਰਾਪਤ ਪੇਪਟਾਇਡ ਵਿੱਚ ਦੋ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਇੱਕ Asn ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ ਤੇ ਅਤੇ ਦੂਸਰਾ ਸੀ-ਟਰਮਿਨਸ ਵਿੱਚ Lys ਦੀ ਸਾਈਡ ਚੇਨ ਤੇ।ਇਸ ਲਈ, ਪ੍ਰੋਪੀਲ ਸਮੂਹਾਂ ਨੂੰ ਦੋਵਾਂ ਸਿਰਿਆਂ 'ਤੇ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਗੈਰ-NMPylated ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੇ ਐਕਸਟਰੈਕਟਡ ਆਇਨ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗਰਾਮ ਨੂੰ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S5B ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਅਤੇ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ (ਮੋਨੋ) ਪ੍ਰੋਪਾਈਲੇਟਡ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S5B, ਉਪਰਲੀ ਲੇਨ) ਅਤੇ ਡਾਇਪ੍ਰੋਪਾਈਲੇਟਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S5B, ਹੇਠਲੀ ਲੇਨ) ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਇਹ ਪੈਟਰਨ nsp9 ਦੇ NMPylated N-ਟਰਮੀਨਲ ਪੇਪਟਾਇਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਨਾਲ ਬਦਲਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਕੇਸ ਵਿੱਚ, ਸਿਰਫ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰੋਪਾਈਲੇਟਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ, ਪਰ ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰੋਪਾਈਲੇਟਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਅਤੇ ਡਿਪਰੋਪਾਈਲੇਟਡ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਦੀ ਪਛਾਣ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S5C), ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ UMP ਨੂੰ N-ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕਰਨ ਤੋਂ ਰੋਕਣ ਲਈ। ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਸਮੂਹ.
ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ ਟੀਚਾ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਨੂੰ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ ਕਰਨ ਲਈ nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ ਬਦਲਦੇ ਹਾਂ (ਅਲਾ ਜਾਂ ਸੇਰ ਨਾਲ) ਜਾਂ ਮਿਟਾਉਂਦੇ ਹਾਂ।ਸਾਡੇ MS ਡੇਟਾ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ NiRAN nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ ਨਾਲ ਇੱਕ nsp9-NMP ਐਡਕਟ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਕਿ nsp9 NMPylation ਨੂੰ ਵਾਇਰਲ ਮਾਸਟਰ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ (Mpro, nsp5) ਤੋਂ nsp9 N-ਟਰਮੀਨਲ ਨੂੰ ਜਾਰੀ ਕਰਨ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ। ਇਸ ਦੇ ਪੌਲੀਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੂਰਵਗਾਮੀ.ਇਸ ਪਰਿਕਲਪਨਾ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਈ. ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ nsp9 ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਇੱਕ ਪੂਰਵ ਪ੍ਰੋਟੀਨ nsp7-11 ਦਾ ਉਤਪਾਦਨ ਕੀਤਾ ਅਤੇ [α-32P] UTP (ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਵਿਧੀਆਂ) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮਿਆਰੀ NMPylation ਟੈਸਟ ਕੀਤਾ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 5A (ਲੇਨ 3) ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਬਿਨਾਂ ਕੱਟੇ ਹੋਏ nsp7-11 ਪੂਰਵ-ਸੂਚਕ ਨੂੰ nsp12 ਨਾਲ ਰੇਡੀਓ ਲੇਬਲ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।ਇਸ ਦੇ ਉਲਟ, ਜੇਕਰ nsp7-11 ਨੂੰ ਪੂਰਵ-ਸੂਚਕ ਤੋਂ nsp9 (ਅਤੇ ਹੋਰ nsps) ਨੂੰ ਛੱਡਣ ਲਈ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ nsp5 ਦੁਆਰਾ ਕਲੀਵ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਇੱਕ ਰੇਡੀਓਲੇਬਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੋ nsp9 ਨਾਲ ਮਾਈਗਰੇਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਖੋਜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਸਾਡੇ ਸਿੱਟੇ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ NiRAN ਅਤੇ N- covalent nsp9-NMP ਐਡ ਦੇ ਚੋਣਵੇਂ ਗਠਨ. .N-ਟਰਮੀਨਲ Asn ਦਾ ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ (pp1a/pp1ab ਵਿੱਚ ਸਥਿਤੀ 3825)।ਇਹ ਸਿੱਟਾ nsp9 ਕੰਸਟਰੱਕਟ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਸਮਰਥਿਤ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ N-ਟਰਮਿਨਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ ਵਾਧੂ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ।ਦੋਵਾਂ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, nsp9 ਦੇ NiRAN-ਵਿਚੋਲੇ UMPylation ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S7)।ਅੱਗੇ, ਅਸੀਂ nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ 'ਤੇ 3825-NNEIMPK-3832 ਪੇਪਟਾਇਡ ਕ੍ਰਮ ਤੋਂ ਹਟਾਏ ਗਏ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ Asn ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ।ਦੋਵਾਂ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ, nsp9 UMPylation ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਬਲੌਕ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ (ਚਿੱਤਰ 5B), ਵਾਧੂ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ ਅਸਲ nsp9 N-ਟਰਮਿਨਸ ਇੱਕ NMP ਰੀਸੈਪਟਰ ਵਜੋਂ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।
nsp9 ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਟਿਕ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਅਤੇ nsp12-ਵਿਚੋਲੇ UMPylation ਵਿੱਚ N-ਟਰਮੀਨਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ।(A) nsp9 UMPylation ਲਈ ਇੱਕ ਮੁਫ਼ਤ nsp9 N-ਟਰਮੀਨਲ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।Nsp7-11-His6 ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਐਮਪਰੋ (nsp5-His6) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਜਾਂ ਗੈਰਹਾਜ਼ਰੀ ਵਿੱਚ UTP ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ NMPylation ਖੋਜ ਬਫਰ ਵਿੱਚ 30 °C 'ਤੇ ਪ੍ਰੀ-ਇਨਕਿਊਬੇਟ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।3 ਘੰਟਿਆਂ ਬਾਅਦ, ਸਮੱਗਰੀ ਅਤੇ ਢੰਗਾਂ ਵਿੱਚ ਵਰਣਨ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ nsp12-His6 ਜੋੜ ਕੇ NMPylation ਪਰਖ ਸ਼ੁਰੂ ਕਰੋ।nsp5-His6 (ਲੇਨ 1) ਅਤੇ nsp9-His6 (ਲੇਨ 2) ਵਾਲੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।10 ਮਿੰਟਾਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਮਿਸ਼ਰਣ ਨੂੰ SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ.ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਕੂਮਾਸੀ ਬ੍ਰਿਲੀਅਨ ਬਲੂ (ਏ, ਸਿਖਰ) ਨਾਲ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।Nsp7-11-His6 ਪਰੀਸਰਸਰ ਅਤੇ nsp5-His6 ਵਿਚੋਲੇ ਕਲੀਵੇਜ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਪ੍ਰੋਸੈਸਡ ਉਤਪਾਦ ਸੱਜੇ ਪਾਸੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਕਿਰਪਾ ਕਰਕੇ ਨੋਟ ਕਰੋ (ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੇ ਛੋਟੇ ਆਕਾਰ ਦੇ ਕਾਰਨ) ਕਿ ਇਸ ਜੈੱਲ ਵਿੱਚ nsp7 ਅਤੇ nsp11-His6 ਖੋਜਣ ਯੋਗ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਅਤੇ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ nsp5-His6 (ਲੇਨ 1 ਅਤੇ 4; nsp5-His6 ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਇੱਕ ਠੋਸ ਚੱਕਰ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਈ ਗਈ ਹੈ) ਨਾਲ ਪੂਰਕ ਹੈ। ਜਾਂ nsp9-His6 (ਲੇਨ 2) ਵਿੱਚ ਬਕਾਇਆ ਅਸ਼ੁੱਧੀਆਂ ਵਜੋਂ MBP (ਖੁੱਲ੍ਹੇ ਚੱਕਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਏ ਗਏ) ਦੀ ਇੱਕ ਛੋਟੀ ਜਿਹੀ ਮਾਤਰਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ MBP ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1) ਵਜੋਂ ਦਰਸਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।(ਬੀ) Nsp9-His6 ਵੇਰੀਐਂਟ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਜਾਂ ਦੋ N-ਟਰਮੀਨਲ Asn ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਘਾਟ ਹੈ (pp1a/pp1ab ਵਿੱਚ ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਸੰਖਿਆ) ਅਤੇ ਇਸਨੂੰ nsp12-His6 ਅਤੇ [α-32P] UTP ਨਾਲ ਸ਼ੁੱਧ ਅਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।B, Coomassie ਨਾਲ ਦਾਗਿਆ SDS-PAGE ਸਿਖਰ 'ਤੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, B, ਅਨੁਸਾਰੀ ਆਟੋਰੇਡੀਓਗ੍ਰਾਫ ਹੇਠਾਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।ਅਣੂ ਭਾਰ ਮਾਰਕਰ (ਕਿਲੋਡਾਲਟਨ ਵਿੱਚ) ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਖੱਬੇ ਪਾਸੇ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਹੈ।(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-ਟਰਮੀਨਲ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ Ala ਜਾਂ Ser ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ nsp12-His6 ਵਿਚੋਲੇ UMPylation ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਇੱਕੋ ਮਾਤਰਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਉਤਪਾਦਾਂ ਨੂੰ SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ Coomassie Brilliant Blue (C, top), ਅਤੇ radiolabled nsp9-His6 ਨੂੰ ਫਾਸਫੋਰਸੈਂਸ ਇਮੇਜਿੰਗ (C, ਮੱਧ) ਦੁਆਰਾ ਖੋਜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ (ਡਬਲਯੂ.ਟੀ.) ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸੰਦਰਭ (100% ਤੇ ਸੈੱਟ) ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ, ਅਨੁਸਾਰੀ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ (ਮਤਲਬ ± SEM) ਨੂੰ ਤਿੰਨ ਸੁਤੰਤਰ ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਗਿਣਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।(ਡੀ) HCoV-229E ਜੰਗਲੀ-ਕਿਸਮ ਦੇ Huh-7 ਸੈੱਲਾਂ ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ Huh-7 ਸੈੱਲਾਂ ਦੇ p1 ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਸੁਪਰਨੇਟੈਂਟ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਟਾਇਟਰ, ਅਤੇ nsp9 ਵਿੱਚ ਮਨੋਨੀਤ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਬਦਲ ਵਾਲੇ ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਪਲੇਕ ਪਰਖ ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ-ਘਾਟ RdRp ਮੋਟਿਫ C ਡਬਲ ਮਿਊਟੈਂਟ DD4823/4AA ਨਕਾਰਾਤਮਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।
nsp9 ਦਾ N-ਟਰਮਿਨਸ (ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ 1, 2, 3, ਅਤੇ 6 ਸਥਿਤੀਆਂ) ਆਰਥੋਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰੀਨੀ ਉਪ-ਪਰਿਵਾਰ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S6) ਦੇ ਮੈਂਬਰਾਂ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੈ।nsp12-ਵਿਚੋਲੇ nsp9 NMPylation ਵਿੱਚ ਇਹਨਾਂ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਸੰਭਾਵਿਤ ਭੂਮਿਕਾ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨ ਲਈ, nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਲਗਾਤਾਰ ਦੋ Asn ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੂੰ Ala ਜਾਂ Ser (ਇਕੱਲੇ ਜਾਂ ਸੁਮੇਲ ਵਿੱਚ) ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਵਾਈਲਡ-ਟਾਈਪ nsp9 ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, N3825 ਨੂੰ Ala ਜਾਂ Ser ਨਾਲ ਬਦਲਣ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ nsp12-ਵਿਚੋਲੇ UMPylation (ਚਿੱਤਰ 5C) ਵਿੱਚ ਦੋ ਗੁਣਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਕਮੀ ਆਈ ਹੈ।ਸਾਡੇ ਸਿੱਟੇ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ ਕਿ NMPylation N-ਟਰਮੀਨਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਸਾਈਡ ਚੇਨ ਦੀ ਬਜਾਏ N-ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ 'ਤੇ ਵਾਪਰਦਾ ਹੈ, ਅਸੀਂ N3825A ਅਤੇ N3825S ਦੀ ਥਾਂ ਦੇ ਨਾਲ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ NMPylation ਦੇਖਿਆ ਹੈ।ਦਿਲਚਸਪ ਗੱਲ ਇਹ ਹੈ ਕਿ, ਜੇਕਰ ਦੂਜੇ Asn ਨੂੰ Ala ਜਾਂ Ser ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ nsp9 UMPylation ਨੂੰ ਵਧੇਰੇ ਮਜ਼ਬੂਤੀ ਨਾਲ ਘਟਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (10 ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਾਰ), ਜਦੋਂ ਕਿ ਸਥਿਤੀ 3, 4, ਅਤੇ 6 'ਤੇ Ala ਨੂੰ ਬਦਲਣ ਦਾ nsp9 UMPylation (ਚਿੱਤਰ 2) 'ਤੇ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। ) .5C).ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ATP, CTP ਜਾਂ GTP (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S8) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਨ।ਸਮੂਹਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਇਹ ਡੇਟਾ nsp9 NMPylation ਵਿੱਚ N2826 (nsp9 ਵਿੱਚ ਸਥਿਤੀ 2) ਦੀ ਮੁੱਖ ਭੂਮਿਕਾ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।
nsp9 ਅਤੇ NMPylation ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਕਾਰਜਾਤਮਕ ਸਬੰਧਾਂ ਦੇ ਵਾਧੂ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰ (104 ਅਤੇ 113 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ) (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ) ਦੇ nsp9 ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਇੱਕ ਮਲਟੀਪਲ ਕ੍ਰਮ ਅਲਾਈਨਮੈਂਟ (MSA) ਕੀਤੀ। S6)।ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਆਰਥੋਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰੀਨੇ ਉਪ-ਪਰਿਵਾਰ ਦੀਆਂ 5 ਪੀੜ੍ਹੀਆਂ ਦੀਆਂ 47 (ਜਾਣੀਆਂ ਅਤੇ ਪੁਖਤਾ) ਕਿਸਮਾਂ ਜੋ ਕਿ ਵੱਖੋ-ਵੱਖ ਥਣਧਾਰੀ ਜੀਵਾਂ, ਪੰਛੀਆਂ ਅਤੇ ਸਰੀਪ ਦੇ ਮੇਜ਼ਬਾਨਾਂ ਨੂੰ ਸੰਕਰਮਿਤ ਕਰਦੀਆਂ ਹਨ, ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ ਸਿਰਫ਼ 8 ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨੂੰ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਪਾਇਆ ਗਿਆ।ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਵਿਆਪਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ, ਮਿਟਾਉਣ ਅਤੇ ਸੰਮਿਲਨ ਸਮੇਤ, nsp9 ਦੇ ਸੈਕੰਡਰੀ ਢਾਂਚੇ ਦੇ ਤੱਤਾਂ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਚੱਕਰਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਸਨ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਿਛਲੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਅਧਿਐਨਾਂ (26 ??28) ਦੁਆਰਾ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।nsp9 ਦੇ C-ਟਰਮੀਨਲ ਹਿੱਸੇ ਦੇ β ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਅਤੇ α ਹੈਲਿਕਸ ਵਿੱਚ ਪੰਜ ਅਸਥਿਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਪਾਏ ਗਏ ਸਨ।ਤਿੰਨ ਅਸਥਿਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ nsp9 ਦੇ N ਟਰਮਿਨਸ ਦਾ NNE ਮੋਟਿਫ ਬਣਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਇਹ ਖੁਲਾਸਾ ਹੋਇਆ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਨਮੂਨੇ ਦਾ ਦੂਜਾ ਅਸਨ ਇਕਮਾਤਰ ਅਸਥਿਰ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਦੂਰੋਂ ਸਬੰਧਤ ਡੱਡੂ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦੇ ਕਲਪਨਾਤਮਕ nsp9 ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਸਾਂਝਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ ਅਲਫਾਲੇਟੋਵਾਇਰਸ ਦੇ ਉਪ-ਪਰਿਵਾਰ ਲੇਟੋਵਾਇਰੀਨੇ ਵਿੱਚ ਮਾਈਕ੍ਰੋਹਾਈਲਾ ਲੈਟੋਵਾਇਰਸ 1 ਸਪੀਸੀਜ਼ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ।nsp9 ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਤੱਤਾਂ ਵਿੱਚ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਸੰਭਾਲ ਨੂੰ ਫੋਲਡਿੰਗ ਜਾਂ ਜਾਣੀਆਂ RNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਨੂੰ ਕਾਇਮ ਰੱਖਣ ਲਈ ਢਾਂਚਾਗਤ ਵਿਚਾਰਾਂ ਦੁਆਰਾ ਤਰਕਸੰਗਤ ਬਣਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਤਰਕ NNE ਦੇ ਬਚਾਅ 'ਤੇ ਲਾਗੂ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਸੀਮਿਤ ਕਰਨ ਵਾਲੀਆਂ ਰੁਕਾਵਟਾਂ ਦੀ ਪ੍ਰਕਿਰਤੀ ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਅਸਪਸ਼ਟ ਸੀ।
ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ nsp9-NMPylation ਅਤੇ NNE ਸੰਭਾਲ ਦੇ ਮਹੱਤਵ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ HCoV-229E ਮਿਊਟੈਂਟਸ ਦਾ ਉਤਪਾਦਨ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਕਿ nsp9 N-ਟਰਮੀਨਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਸਿੰਗਲ ਜਾਂ ਡਬਲ ਬਦਲ ਲੈ ਕੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ nsp9 NMPylation ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ ਨੁਕਸਾਨਦੇਹ ਹੈ।ਸ਼ੁਰੂ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਅਸੀਂ ਇਸ ਸਵਾਲ ਦਾ ਜਵਾਬ ਦੇਣ ਦੀ ਕੋਸ਼ਿਸ਼ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਕੀ ਇਹ ਬਦਲ (nsp8|9 ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟ ਦੇ ਨੇੜੇ) ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ pp1a ਖੇਤਰ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਟਿਕ ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।nsp7-11 ਪੌਲੀਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕੰਸਟਰੱਕਟਸ ਦਾ ਇੱਕ ਸੈੱਟ nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਅਨੁਸਾਰੀ ਬਦਲਾਂ ਨੂੰ E. ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ ਤਿਆਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ Mpro ਨਾਲ ਕੱਟਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਚਾਰ ਸਾਈਟਾਂ (nsp9 ਫਲੈਂਕਿੰਗ ਸਾਈਟ ਸਮੇਤ) ਦਾ ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਇਟਿਕ ਕਲੀਵੇਜ ਕਿਸੇ ਵੀ ਪੇਸ਼ ਕੀਤੇ ਬਦਲ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S9) ਦੁਆਰਾ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦਾ, ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤਬਦੀਲੀਆਂ ਨੂੰ ਛੱਡ ਕੇ ਜੋ Mpro-ਵਿਚੋਲੇ nsp8|9 ਕਲੀਵੇਜ (ਜਾਂ ਹੋਰ) ਵਿੱਚ ਦਖਲ ਦਿੰਦੇ ਹਨ। ਵੈੱਬਸਾਈਟ।
Huh-7 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਜੀਨੋਮ-ਲੰਬਾਈ HCoV-229E RNA ਨਾਲ ਤਬਦੀਲ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, nsp9 N ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ NNE ਟ੍ਰਿਪੇਪਟਾਈਡਸ (N3825, N3826, ਅਤੇ E3827) ਵਿੱਚ ਏਨਕੋਡਿੰਗ ਅਲਾ ਜਾਂ Ser ਬਦਲਾਵ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਪਰਿਵਰਤਨ ਘਾਤਕ ਹਨ।ਅਸੀਂ N-ਟਰਮੀਨਲ Asn (N2835A ਜਾਂ N2835S) ਦੇ Ser ਜਾਂ Ala ਨੂੰ ਬਦਲ ਕੇ ਵਾਇਰਸ ਨੂੰ ਬਚਾਉਣ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ, ਪਰ NNE ਕ੍ਰਮ (N3826A, N3826S, NN3825/6AA) ਵਿੱਚ ਹੋਰ ਸਿੰਗਲ ਅਤੇ ਡਬਲ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨਾਲ ਵਾਇਰਸ ਨੂੰ ਮੁੜ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਫਲ ਰਹੇ। NN3825/6SS), E3827A) (ਚਿੱਤਰ 5D)।
ਇਹ ਨਤੀਜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਟਿਸ਼ੂ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦੀ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਸੀਮਤ ਹੈ (ਇੱਕੋ ਜਾਂ ਸਮਾਨ), ਸਰੀਰ ਵਿੱਚ nsp9 NMPylation ਸਾਈਟਾਂ ਦੇ ਕੁਦਰਤੀ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਸੀਮਿਤ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦੇ ਜੀਵਨ ਚੱਕਰ ਵਿੱਚ ਇਸ ਪ੍ਰਤੀਕਿਰਿਆ ਦੀ ਮੁੱਖ ਭੂਮਿਕਾ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।
ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਦੇ ਆਖਰੀ ਸੈੱਟ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ C-ਟਰਮੀਨਲ His6 ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ SARS-CoV-2 nsp12 ਅਤੇ nsp9, ਅਤੇ E. ਕੋਲੀ ਵਿੱਚ nsp12 ਦੇ ਦੋ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਰੂਪ ਤਿਆਰ ਕੀਤੇ।NiRAN ਅਤੇ RdRp ਡੋਮੇਨਾਂ ਵਿੱਚ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਕ੍ਰਮਵਾਰ ਅਲਾ ਦੀ ਬਜਾਏ ਵਰਤੋ (ਚਿੱਤਰ 6A ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S2)।SARS-CoV-2 nsp12 ਵਿੱਚ K4465 HCoV-229E (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S2) ਵਿੱਚ K4135 ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ NiRAN ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ HCoV-229E ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ (ਚਿੱਤਰ 3D ਅਤੇ E) ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ ਸਾਬਤ ਹੋਇਆ।ਇਹ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਧਮਣੀ ਦੇ ਵਾਇਰਸ EAV nsp9 K94 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨਾਲ ਵੀ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਪਹਿਲਾਂ NiRAN ਸਵੈ-ਯੂਐਮਪੀਲੇਸ਼ਨ/ਸੈਲਫ-ਜੀਐਮਪੀਲੇਸ਼ਨ (16) ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਦਿਖਾਈ ਗਈ ਸੀ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਚਿੱਤਰ 6B ਵਿੱਚ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, SARS-CoV-2 nsp12 ਵਿੱਚ nsp9 ਨੂੰ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ UMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ nsp12_K4465A ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਮਿਊਟੈਂਟ ਅਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਹੈ।RdRp ਮੋਟਿਫ C ਦੇ SDD ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਕ੍ਰਮ ਵਿੱਚ ਦੋਹਰਾ ਬਦਲ UMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ (ਚਿੱਤਰ 6B) ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ nsp9 UMPylation ਵਿੱਚ RdRp ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਾ ਕੋਈ ਸਿੱਧਾ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦਾ ਡਾਟਾ CTP, GTP ਅਤੇ ATP (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S10) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਅੰਕੜੇ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ NiRAN-ਵਿਚੋਲੇ nsp9 NMPylation ਦੀ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਰੂੜੀਵਾਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ ਜੋ ਆਰਥੋਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਉਪ-ਪਰਿਵਾਰ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪੀੜ੍ਹੀਆਂ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ।
SARS-CoV-2 nsp9 ਦਾ nsp12-ਵਿਚੋਲਾ NMPylation.(A) NMPylation ਟੈਸਟ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਦਿਖਾਉਂਦੇ ਹੋਏ ਕੂਮੈਸੀ ਸਟੈਨਡ ਐਸਡੀਐਸ-ਪੌਲੀਕ੍ਰੀਲਾਮਾਈਡ ਜੈੱਲ।ਇੱਕ ਨਿਯੰਤਰਣ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ, SARS-CoV-2 nsp12 ਦੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ (K4465A) ਅਤੇ RdRp ਡੋਮੇਨ (DD5152/3AA) ਵਿੱਚ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਬਦਲ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਮਿਊਟੈਂਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਸੰਖਿਆ pp1ab ਵਿੱਚ ਸਥਿਤੀ 'ਤੇ ਅਧਾਰਤ ਹੈ।(ਬੀ) nsp9-His6 ਅਤੇ [α-32P]UTP ਨੂੰ nsp12-His6 (ਜੰਗਲੀ ਕਿਸਮ [wt] ਅਤੇ ਮਿਊਟੈਂਟ) ਦੇ ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦੇ ਹੋਏ UMPylation ਖੋਜ ਦਾ ਆਟੋਰੇਡੀਓਗ੍ਰਾਫ।ਲੇਬਲ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦਾ ਅਣੂ ਪੁੰਜ (ਕਿਲੋਡਾਲਟਨ ਵਿੱਚ) ਖੱਬੇ ਪਾਸੇ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਨੀਰਾਨ ਡੋਮੇਨ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨਿਡੋਵਾਇਰਲਸ (16) ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ ਕਿ ਉਹ ਨਿਡੋਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮੈਟਿਕ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, ਅਸੀਂ ਇਹ ਸਾਬਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ ਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦਾ NiRAN ਡੋਮੇਨ NMP (NTP ਤੋਂ ਤਿਆਰ) ਨੂੰ nsp9 ਵਿੱਚ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇੱਕ ਰਹੱਸਮਈ ਆਰਐਨਏ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜੋ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ (26?? 29), ਇਸਨੂੰ ਇੱਕ ਕੁਦਰਤੀ ਨਿਸ਼ਾਨੇ ਵਜੋਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨ ਲਈ ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਆਰਟੀਸੀ ਦਾ ਸਾਥੀ।
NiRAN ਡੋਮੇਨ ਤਿੰਨ ਕ੍ਰਮ ਰੂਪਾਂ (AN, BN, ਅਤੇ CN) ਨੂੰ ਸਾਂਝਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਗਿਣਤੀ ਵਿੱਚ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦੇ ਹਨ ਜੋ ਮੋਨੋਫਾਈਲੈਟਿਕ ਪਰ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਵਿਭਿੰਨ ਨਿਡੋਵਾਇਰਲਸ ਆਰਡਰ (8, 16) ਵਿੱਚ ਸਾਰੇ ਪਰਿਵਾਰਾਂ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ।ਹਾਲੀਆ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਉਹ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨੇਸ-ਵਰਗੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਇੱਕ ਵੱਡੇ ਪੱਧਰ 'ਤੇ ਅਣਪਛਾਤੇ ਪਰਿਵਾਰ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਹਨ, ਜਿਨ੍ਹਾਂ ਨੂੰ ਅਸਲ ਵਿੱਚ ਸੇਲੋ ਪਰਿਵਾਰ (17, 19, 22, 30, 31) ਕਿਹਾ ਜਾਂਦਾ ਸੀ।ਸੇਲੋ-ਸਬੰਧਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਕਿਨਾਜ਼ ਫੋਲਡ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਪਰ ਕਲਾਸੀਕਲ ਕਿਨਾਜ਼ (22, 32) ਵਿੱਚ ਕਈ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟਾਂ ਦੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਘਾਟ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।ਏਟੀਪੀ ਅਣੂਆਂ ਦੇ ਉਲਟ ਸਥਿਤੀ ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ ਕਿਰਿਆਸ਼ੀਲ ਸਾਈਟ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹੇ ਹੋਏ ਅਤੇ ਖਾਸ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੁਆਰਾ ਸਥਿਰ ਕੀਤੇ ਗਏ, SelO ਨੂੰ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਬਸਟਰੇਟ (22) ਵਿੱਚ AMP (ਫਾਸਫੇਟ ਦੀ ਬਜਾਏ) ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਨ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਇੱਕ ਹੋਰ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਸੇਲੋ-ਵਰਗੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ YdiU ਹੈ। ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ Tyr ਅਤੇ ਉਸ ਦੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ (33) ਦੇ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਨਾਲ UMP ਦੇ ਸਹਿ-ਸੰਚਾਲਕ ਅਟੈਚਮੈਂਟ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਕਰਨ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ।
ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਪੁਟੇਟਿਵ ਐਕਟਿਵ ਸਾਈਟ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਦੀ ਪੁਸ਼ਟੀ ਅਤੇ ਵਿਸਤਾਰ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ nsp12 (ਚਿੱਤਰ 3D ਅਤੇ E ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3 ਅਤੇ ਸਾਰਣੀ) S1â 'ਤੇ ਪਰਿਵਰਤਨ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਬਾਇਓਕੈਮੀਕਲ ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਜੈਨੇਟਿਕਸ ਤਰੀਕਿਆਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ। S4).ਡੇਟਾ ਦਿਖਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ HCoV-229E K4135, R4178 ਅਤੇ D4280 ਨੂੰ Ala ਨਾਲ ਬਦਲਣ ਨਾਲ ਐਨਟੀਪੀ γ-ਫਾਸਫੇਟ ਵਿੱਚ ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ (ਚਿੱਤਰ 3D ਅਤੇ E ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3) ਵਿੱਚ ਵਿਟਰੋ NMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਦਾ ਹੈ। (K4135, R4178) ਅਤੇ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਮੈਟਲ ਆਇਨਾਂ (D4280) ਦਾ ਤਾਲਮੇਲ।K4135 (17) ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਸਥਿਰ ਕਰਨ ਦੀ ਭਵਿੱਖਬਾਣੀ ਕੀਤੀ ਪੰਛੀ ਦੇ ਆਲ੍ਹਣੇ ਦੇ ਵਾਇਰਸ ਦੀ ਰੇਂਜ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਗਲੂ ਦੇ E4145A ਬਦਲ ਨੂੰ ਵਾਇਰਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਨ ਲਈ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਪਰ ਹੈਰਾਨੀ ਦੀ ਗੱਲ ਹੈ ਕਿ, ਇਨ ਵਿਟਰੋ NMPylation ਪਰਖ (ਚਿੱਤਰ 3D ਅਤੇ E ਅਤੇ) ਵਿੱਚ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਸੀ। SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3 ਅਤੇ ਟੇਬਲ S1–S4)।ਇੱਕ ਸਮਾਨ ਨਿਰੀਖਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਦੋਂ ਸਾਲਮੋਨੇਲਾ ਟਾਈਫਿਮੂਰੀਅਮ (E130A) (33) ਦੇ YdiU ਸਮਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸੰਬੰਧਿਤ ਬਦਲ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਕੱਠੇ ਕੀਤੇ ਗਏ, ਇਹ ਡੇਟਾ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦੀ ਬਜਾਏ ਇਸ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਫੰਕਸ਼ਨ ਦਾ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।
HCoV-229E NiRAN ਡੋਮੇਨ (8) ਵਿੱਚ ਨੇਸਟੋਵਾਇਰਸ ਦੀ ਸੀਮਾ ਦੇ ਅੰਦਰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ Phe ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (F4281A) ਨੂੰ ਬਦਲਣ ਦੇ ਨਤੀਜੇ ਵਜੋਂ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਆਈ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਮੀ ਆਈ (ਚਿੱਤਰ 3D, E ਅਤੇ SI) ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3)।ਡੇਟਾ ਇਸ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦਿਖਾਇਆ ਗਿਆ ਸਮਰੂਪ DFG ਮੋਟਿਫ Phe ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ।ਕਲਾਸੀਕਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨਾਸਿਸ ਵਿੱਚ, ਇਹ Mg2+ ਬਾਈਡਿੰਗ ਲੂਪ ਦਾ ਹਿੱਸਾ ਹੈ ਅਤੇ ਰੀੜ੍ਹ ਦੀ ਹੱਡੀ ਨੂੰ ਇਕੱਠਾ ਕਰਨ ਅਤੇ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰਦਾ ਹੈ???ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਲਈ ਲੋੜੀਂਦਾ ਹੈ (32, 34).K4116 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (preAN ਮੋਟਿਫ ਵਿੱਚ) ਲਈ Ala ਅਤੇ Arg ਨੂੰ ਬਦਲਣਾ, ਕ੍ਰਮਵਾਰ, ਵਾਇਰਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਪੇਸ਼ ਕੀਤੀ ਗਈ ਐਮੀਨੋ ਐਸਿਡ ਸਾਈਡ ਚੇਨ (ਚਿੱਤਰ 3D ਅਤੇ E ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ) ਦੇ ਅਧਾਰ ਤੇ, ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ NMP ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਗਤੀਵਿਧੀ 'ਤੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸਨ। , ਚਿੱਤਰ S3)।ਫੰਕਸ਼ਨਲ ਡੇਟਾ ਢਾਂਚਾਗਤ ਜਾਣਕਾਰੀ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਨੇ ਏਟੀਪੀ ਫਾਸਫੇਟ (17) ਨਾਲ ਇੱਕ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਹੋਰ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰਾਂ ਦੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ਦੀ ਸਥਿਤੀ Lys, Arg ਜਾਂ His (8) ਦੁਆਰਾ ਰੱਖੀ ਗਈ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਖਾਸ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਪਾਬੰਦੀ ਨੂੰ ਢਿੱਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਹੈ।D4188A ਅਤੇ D4283A ਦਾ ਬਦਲ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਦਾ ਹੈ ਜਾਂ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਢੰਗ ਨਾਲ ਘਟਾਉਂਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨੂੰ ਖਤਮ ਕਰਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 3).ਇਹ ਦੋ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ (ਪਰ ਸਾਰੇ ਨਹੀਂ) ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ (8) ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ, ਇੱਕ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਪਰਿਵਾਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਪਰ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਗੈਰ-ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਫੰਕਸ਼ਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ।ਕਈ ਹੋਰ Lys ਅਤੇ Asp ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (K4113A, D4180A, D4197A ਅਤੇ D4273A) ਦੇ ਅਲਾ ਬਦਲ ਜੋ ਕਿ ਕਰੋਨਾਵਾਇਰੀਡੇ ਜਾਂ ਹੋਰ ਨੇਸਟੀਓਵਾਇਰੀਡੇ ਪਰਿਵਾਰਾਂ (8) ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਨਹੀਂ ਹਨ, ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਣ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਉਮੀਦ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਇਹ ਬਦਲ ਬਹੁਤ ਹੱਦ ਤੱਕ ਸਹਿਣਯੋਗ ਹਨ, ਕੁਝ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਗਤੀਵਿਧੀ ਅਤੇ ਵਾਇਰਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ ਮਾਮੂਲੀ ਕਮੀ ਦੇ ਨਾਲ (ਚਿੱਤਰ 3 ਅਤੇ ਐਸਆਈ ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3)।ਕੁੱਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਡੇਟਾ EAV NiRAN-RdRp (16) ਦੇ ਸਵੈ-ਜੀਐਮਪੀ ਅਤੇ ਰਿਵਰਸ ਜੈਨੇਟਿਕਸ ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ ਬਹੁਤ ਇਕਸਾਰ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ EAV nsp9 (ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ nsp12 ਆਰਥੋਲੋਗ) ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ K94 (HCoV- 229E K4135 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ), ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕਾਰਜ ਹਨ। R124 (R4178 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ), D132 (D4188 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ), D165 (D4280 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ), F166 (F4281 ਦੇ ਅਨੁਸਾਰੀ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, HCoV-229E ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਡੇਟਾ ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਗਏ SARS-CoV ਰਿਵਰਸ ਜੈਨੇਟਿਕਸ ਡੇਟਾ (16) ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਅਤੇ ਫੈਲਾਇਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਬਿਲਕੁਲ ਉਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸੰਬੰਧਿਤ CN ਮੋਟਿਫ Phe-to-Ala ਮਿਊਟੈਂਟ SARS-CoV_nsp12 ਲਈ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ। ਵਰਣਿਤ ਫੀਨੋਟਾਈਪ -F219A ਅਤੇ HCoV-229E_F4281A (ਚਿੱਤਰ 3 D ਅਤੇ E ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3 ਅਤੇ ਸਾਰਣੀ S1-S4)।
ਈਏਵੀ ਆਰਥੋਲੋਗਸ (16) ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ UTP ਅਤੇ GTP (ਸਵੈ-NMPylation ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ) ਲਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਤਰਜੀਹ ਹੈ, ਸਾਡਾ ਅਧਿਐਨ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ NiRAN ਡੋਮੇਨ (HCoV-229E ਅਤੇ SARS-CoV-2 ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਸਤੁਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ) ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ ਹੋ ਸਕਦਾ ਹੈ। ਸਾਰੇ ਚਾਰ NMPs ਦਾ ਤਬਾਦਲਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਹਾਲਾਂਕਿ UMP (ਅੰਕੜੇ 1 ਅਤੇ 3) ਲਈ ਥੋੜ੍ਹੀ ਜਿਹੀ ਤਰਜੀਹ ਹੈ।ਖਾਸ NTP ਕੋ-ਸਬਸਟਰੇਟ ਦੀ ਮੁਕਾਬਲਤਨ ਘੱਟ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਗਈ SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 ਸੁਪਰਕੰਪੋਜ਼ਿਟ ਬਣਤਰ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ADP-Mg2+ NiRAN ਦੀ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ, ਪਰ ਐਡੀਨਾਈਨ ਭਾਗ ਨਾਲ ਨਹੀਂ। ਖਾਸ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਦੇ ਗਠਨ (17).ਸਾਡੇ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ, NMPylation ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਵਿੱਚ ਵਰਤੇ ਗਏ ਨਿਊਕਲੀਓਟਾਈਡ ਦੀ ਕਿਸਮ ਦਾ ਪਰਿਵਰਤਨਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S3) ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ 'ਤੇ ਕੋਈ ਅੰਤਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨਹੀਂ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੋਈ ਵੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਕਿਸੇ ਖਾਸ ਨਿਊਕਲੀਓਬੇਸ ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ ਨਾਲ ਨੇੜਿਓਂ ਸਬੰਧਤ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਅਤੇ ਧਮਣੀਦਾਰ ਵਾਇਰਸਾਂ ਦੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਦੇਖੇ ਗਏ ਵੱਖ-ਵੱਖ NTP ਸਹਿ-ਸਬਸਟਰੇਟ ਤਰਜੀਹਾਂ ਦੇ ਢਾਂਚਾਗਤ ਆਧਾਰ ਅਤੇ ਸੰਭਾਵੀ ਜੈਵਿਕ ਮਹੱਤਤਾ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨਾ ਬਾਕੀ ਹੈ;ਉਹ ਸੱਚ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ ਜਾਂ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸਬੰਧਤ ਅਧਿਐਨਾਂ ਦੀਆਂ ਸੀਮਾਵਾਂ ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ, ਇਸ ਗੱਲ ਤੋਂ ਇਨਕਾਰ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਕਿ ਧਮਨੀਆਂ ਦੇ ਵਾਇਰਸ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਸੰਭਾਵੀ NMPylator ਗਤੀਵਿਧੀ (ਪਹਿਲਾਂ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਸਵੈ-NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ) ਦੀ ਇੱਕ ਵੱਖਰੀ ਸਹਿ-ਸਬਸਟਰੇਟ ਤਰਜੀਹ ਹੈ, ਇਸ ਗੱਲ ਨੂੰ ਧਿਆਨ ਵਿੱਚ ਰੱਖਦੇ ਹੋਏ ਕਿ ਧਮਣੀ ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਵਿਚਕਾਰ ਸਮਾਨਤਾ ਹੈ। NiRAN ਡੋਮੇਨ ਆਪਣੀ ਸੀਮਾ 'ਤੇ ਹੈ।ਕ੍ਰਮ-ਅਧਾਰਿਤ ਤੁਲਨਾ (16)।pseudokinase SelO, ਜੋ ਕਿ Mg2+ ਨੂੰ ਕੋਫੈਕਟਰ ਵਜੋਂ ਵਰਤਦਾ ਹੈ, ਦੀ ਤੁਲਨਾ ਵਿੱਚ, ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਅਤੇ ਧਮਣੀ ਵਾਲੇ ਵਾਇਰਸ NiRAN ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ Mn2+ (16) (ਚਿੱਤਰ 3C ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S1) 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੀ ਹੈ।Mn2+ ਨਿਰਭਰਤਾ ਅਤੇ UTP ਲਈ ਸਪੱਸ਼ਟ ਤਰਜੀਹ ਪ੍ਰੋਟੀਨ NMPylators ਦੀ ਇੱਕ ਅਸਾਧਾਰਨ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਸਾਲਮੋਨੇਲਾ ਟਾਈਫਿਮੁਰੀਅਮ ਦੇ YdiU ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ, ਜੋ ਤਣਾਅ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਸੈੱਲ ਏਟੀਪੀ ਪੂਲ (ਸੈੱਲ ਏਟੀਪੀ ਪੂਲ) ਤੋਂ ਸੈੱਲਾਂ ਦੀ ਰੱਖਿਆ ਕਰਨ ਲਈ ਸਖਤ Mn2+-ਨਿਰਭਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਚੈਪਰੋਨ UMPylation ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। 33)।
ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਅਤੇ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਕਿਨਾਸੇਸ (17, 19) ਵਿਚਕਾਰ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਵਰਣਨ ਕੀਤੀ ਗਈ ਢਾਂਚਾਗਤ ਸਮਾਨਤਾ ਨਿਰਾਨ ਦੀ NMP ਨੂੰ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਜੋੜਨ ਦੀ ਸਮਰੱਥਾ ਲਈ ਵਾਧੂ ਸਹਾਇਤਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ ਜੋ ਅਸੀਂ ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀ ਹੈ।ਅਸੀਂ HCoV-229E ORF1a ਦੁਆਰਾ ਏਨਕੋਡ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ 'ਤੇ ਸੰਭਾਵਿਤ ਨਿਰਾਨ ਟੀਚਿਆਂ ਲਈ ਸਾਡੀ ਖੋਜ ਨੂੰ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ, ਜੋ ਸਿੱਧੇ ਜਾਂ ਅਸਿੱਧੇ ਤੌਰ 'ਤੇ RTC ਦੇ ORF1b-ਏਨਕੋਡਡ ਰਿਪਲੀਕੇਸ (12, 35) ਦੀ ਸਹਾਇਤਾ ਲਈ ਜਾਣੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ।ਸਾਡੇ ਪ੍ਰਯੋਗ nsp9 (ਚਿੱਤਰ 2) ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਅਤੇ ਖਾਸ NMPylation ਲਈ ਨਿਰਣਾਇਕ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਜੇਕਰ ਟਾਰਗੇਟ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੱਕ ਮੋਲਰ ਵਾਧੂ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ ਜੋ ਐਨਜ਼ਾਈਮ (ਐਨਐਸਪੀ12) ਨਾਲੋਂ 8 ਤੋਂ 10 ਗੁਣਾ ਵੱਧ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਐਨਐਸਪੀ9 ਪੂਰੀ ਤਰ੍ਹਾਂ (ਮੋਨੋ) ਐਨਐਮਪੀਇਜ਼ਡ (ਚਿੱਤਰ 4) ਹੈ।ਅਸੀਂ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਿਆ ਹੈ ਕਿ nsp12 ਅਤੇ nsp9 ਵਿਚਕਾਰ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਥੋੜ੍ਹੇ ਸਮੇਂ ਲਈ ਹੈ ਅਤੇ nsp9 (ਹੋਰ RTC ਸਬ-ਯੂਨਿਟਾਂ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ) ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਸਥਿਰ ਕੰਪਲੈਕਸ ਨਹੀਂ ਬਣੇਗਾ।ਇਹ ਸਿੱਟਾ SARS-CoV ਪ੍ਰੋਟੀਓਮ (35) 'ਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਇੰਟਰਐਕਸ਼ਨ ਅਧਿਐਨ ਦੁਆਰਾ ਸਮਰਥਤ ਹੈ।MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਨੇ NSP9 ਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ ਨੂੰ NMPylation ਸਾਈਟ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S5) ਵਜੋਂ ਪਛਾਣਿਆ।ਫਾਸਫੋਰਮੀਡੇਟ ਬਾਂਡ ਅਤੇ ਐਨ-ਟਰਮੀਨਲ ਅਮੀਨੋ ਗਰੁੱਪ ਦਾ ਗਠਨ ਨੀਰਾਨ-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੀ ਐਨਐਮਪੀਲੇਸ਼ਨ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਸੂਡੋਮੋਨਾਸ ਸੀਰਿੰਜੇ ਸੇਲੋ-ਮੀਡੀਏਟਿਡ ਏਐਮਪੀਲੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਤੋਂ ਵੱਖਰਾ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਸੇਰ, ਥ੍ਰ, ਜਾਂ ਟਾਇਰ ਦੇ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ (ਪੇਪਟਾਇਡ ਐਡੀਡਕਟਸ ਐਡ) ਵਿਖੇ ਓ-ਲਿੰਕਡ ਏਐਮਪੀ ਦੇ ਗਠਨ ਨੂੰ ਉਤਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ। 22), ਅਤੇ S. typhimurium YdiU ਓ-ਲਿੰਕਡ (ਟਾਈਰ ਦੇ ਨਾਲ) ਅਤੇ ਐਨ-ਲਿੰਕਡ (ਉਸ ਦੇ ਨਾਲ) ਪੇਪਟਾਇਡ-ਯੂਐਮਪੀ ਐਡਕਟ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਸੇਲੋ ਪਰਿਵਾਰ 'ਤੇ ਉਪਲਬਧ ਸੀਮਤ ਜਾਣਕਾਰੀ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਵੱਡੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪਰਿਵਾਰ ਦੇ ਮੈਂਬਰ ਪੇਪਟਾਇਡ-ਐਨਐਮਪੀ ਐਡਕਟਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਵਿਚ ਬਹੁਤ ਵੱਖਰੇ ਹਨ।ਇਹ ਇੱਕ ਦਿਲਚਸਪ ਨਿਰੀਖਣ ਹੈ ਜੋ ਹੋਰ ਅਧਿਐਨ ਦਾ ਹੱਕਦਾਰ ਹੈ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਡੇਟਾ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਇਹ ਅਨੁਮਾਨ ਲਗਾਉਣ ਲਈ ਅਗਵਾਈ ਕੀਤੀ ਕਿ nsp9 ਦੇ NMPylation ਲਈ ਇੱਕ ਮੁਫਤ N-ਟਰਮਿਨਸ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ।ਵਾਇਰਲ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਦੇ ਸੰਦਰਭ ਵਿੱਚ, ਇਹ Mpro ਅਤੇ pp1ab ਦੁਆਰਾ ਵਿਚੋਲਗੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਪੌਲੀਪ੍ਰੋਟੀਨ pp1a ਵਿੱਚ nsp8|nsp9 ਪ੍ਰੋਸੈਸਿੰਗ ਸਾਈਟ ਦੇ ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਟਿਕ ਕਲੀਵੇਜ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ।ਜ਼ਿਆਦਾਤਰ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਵਿੱਚ, ਇਸ ਖਾਸ ਸਾਈਟ (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) ਅਤੇ ਹੋਰ ਸਾਰੀਆਂ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਐਮਪ੍ਰੋ ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟਾਂ ਵਿੱਚ ਅੰਤਰ Asn ਹੈ (ਕਿਸੇ ਹੋਰ ਛੋਟੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਬਜਾਏ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਅਲਾ, ਸੇਰ ਜਾਂ ਗਲਾਈ) P1â ਉੱਤੇ ਕਬਜ਼ਾ ਕਰਦੇ ਹਨ???ਸਥਾਨ (36)ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੇ ਪੇਪਟਾਇਡ ਕਲੀਵੇਜ ਡੇਟਾ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਕਿ nsp8|nsp9 ਸਾਈਟ ਦੀ ਕਲੀਵੇਜ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਦੂਜੀਆਂ ਸਾਈਟਾਂ ਨਾਲੋਂ ਘੱਟ ਸੀ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ 1) ਇਸ ਖਾਸ ਸਾਈਟ ਦੀ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਦੀ ਸਮੇਂ ਸਿਰ ਤਾਲਮੇਲ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਭੂਮਿਕਾ ਹੋ ਸਕਦੀ ਹੈ। pp1a ਖੇਤਰ, ਜਾਂ 2) a ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ (37) ਵਿੱਚ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਸੁਰੱਖਿਅਤ nsp9 N-ਟਰਮਿਨਸ ਦੀ ਭੂਮਿਕਾ।ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ (ਚਿੱਤਰ 5A) ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ ਅਸਲ N-ਟਰਮੀਨਲ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਲੈ ਕੇ ਜਾਣ ਵਾਲੇ nsp9 ਦਾ ਮੁੜ ਸੰਜੋਗ ਰੂਪ nsp12 ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਸ਼ਾਲੀ ਢੰਗ ਨਾਲ NMP ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।N-ਟਰਮੀਨਲ ਫਲੈਂਕਿੰਗ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਫੈਕਟਰ Xa (nsp9-His6; SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1) ਜਾਂ Mpro-ਵਿਚੋਲੇ ਵਾਲੀ ਕਲੀਵੇਜ (nsp7-11-His6; ਚਿੱਤਰ 5A ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1) ਦੁਆਰਾ ਹਟਾ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਣਕੁੱਟ nsp9- ਰੱਖਣ ਵਾਲੇ ਪੂਰਵਗਾਮੀ nsp7-11-His6 ਨੇ nsp12 ਦੇ NMPylation ਦਾ ਵਿਰੋਧ ਦਿਖਾਇਆ, ਜੋ ਕਿ ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ nsp9-NMP ਐਡਕਟ N-ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S5) ਦੁਆਰਾ ਬਣਾਈ ਗਈ ਹੈ। .NiRAN ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਦੀ ਡੂੰਘੀ ਸਮਝ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ, ਅਸੀਂ ਫਿਰ nsp9 ਦੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 'ਤੇ ਧਿਆਨ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕੀਤਾ।ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ, ਉਹ ਢਾਂਚਾਗਤ ਤੌਰ 'ਤੇ ਲਚਕਦਾਰ ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਉਹਨਾਂ ਨੂੰ nsp9 (26 28, 38) ਦੇ ਅਣ-ਲੇਬਲ ਵਾਲੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਖੋਜੇ ਜਾਣ ਤੋਂ ਰੋਕਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਉਹਨਾਂ ਦੇ ਸੀਮਤ ਕੁਦਰਤੀ ਪਰਿਵਰਤਨ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦੇ ਹਨ, ਇਹ ਮਹੱਤਵਪੂਰਨ ਕ੍ਰਮ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ (ਸੈਕੰਡਰੀ ਬਣਤਰ ਨਾਲ ਸਬੰਧਤ ਨਹੀਂ) ਦੇ ਕਾਰਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। nsp9 N-ਟਰਮੀਨਲ ਫਰੈਗਮੈਂਟ ਦਾ ਫੰਕਸ਼ਨ।ਇਸ ਖੇਤਰ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਅਲਾ ਬਦਲ (ਅੰਕੜੇ 5C ਅਤੇ D ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S8) ਦੱਸਦੇ ਹਨ ਕਿ N3826 ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ nsp9 NMPylation ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ, ਜਦੋਂ ਕਿ N3825A ਅਤੇ E3827A ਬਦਲਵਾਂ NMPylation ਵਿੱਚ ਕਮੀ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦੀਆਂ ਹਨ, ਜਦੋਂ ਕਿ P3380 ਸਬਸਟੀਟਿਊਸ਼ਨ P3820 ਨਹੀਂ ਕਰਦੇ। .ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ nsp9 NMPylation ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ N-ਟਰਮੀਨਲ Asn (N3825A, N3825S) ਦੇ ਬਦਲ ਦਾ nsp9 NMPylation ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ (ਚਿੱਤਰ 5C ਅਤੇ D) ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ 'ਤੇ ਸਿਰਫ ਇੱਕ ਮੱਧਮ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੈ, N-ਟਰਮੀਨਲ 3825-NN dipe ਤੋਂ ਇੱਕ Asn ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ ਮਿਟਾਉਣਾ. ਸਾਬਤ ਹੋਇਆ ਕਿ ਇਹ ਵਾਇਰਸਾਂ ਲਈ ਘਾਤਕ ਹੈ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ N-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ ਦੂਜੀ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ ਇੱਕ Asn ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਰਜੀਹੀ ਤੌਰ 'ਤੇ Asn, ਹਾਲਾਂਕਿ ਅਜਿਹਾ ਲੱਗਦਾ ਹੈ ਕਿ ਸਮਾਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਬਦਲ ਨੂੰ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਰਦਾਸ਼ਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ (ਚਿੱਤਰ 5B, C, ਅਤੇ D)।ਅਸੀਂ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਦੇ ਹਾਂ ਕਿ 3825-NN ਡਾਇਪੇਪਟਾਇਡ, ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਸੀਮਾ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S6) ਦੇ ਅੰਦਰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਅਤੇ ਜ਼ਰੂਰੀ N3826 ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ, NiRAN ਦੀ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਵਿੱਚ nsp9 N-ਟਰਮਿਨਸ ਦੀ ਸਹੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਅਤੇ ਸਥਿਤੀ ਨੂੰ ਯਕੀਨੀ ਬਣਾਉਂਦਾ ਹੈ।
ਸਾਰੇ ਉਪ-ਪਰਿਵਾਰਾਂ ਦੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਗਲੂ ਲਈ ਅਲਾ (E3827A) ਨੂੰ ਬਦਲਣਾ ਵਿਟਰੋ ਵਿੱਚ nsp9 NMPylation ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖਦਾ ਹੈ ਪਰ ਸੈੱਲ ਕਲਚਰ (ਚਿੱਤਰ 5C ਅਤੇ D) ਵਿੱਚ ਵਾਇਰਸਾਂ ਲਈ ਘਾਤਕ ਹੈ, ਇਸ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੇ ਵਾਧੂ ਕਾਰਜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਮੁੱਖ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ (NMPylated ਜਾਂ ਅਣਸੋਧਿਆ ਹੋਇਆ) ) nsp9 N-ਟਰਮਿਨਸ ਅਤੇ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੋਰ ਕਾਰਕ।Nsp9 ਮਿਊਟੇਸ਼ਨਾਂ ਨੇ nsp9 ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਟਿਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ ਜਾਂ ਕਿਸੇ ਨਾਲ ਲੱਗਦੇ nsps (39) (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ S9) ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵਤ ਨਹੀਂ ਕੀਤਾ, ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਕਈ nsp9 ਮਿਊਟੇਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਘਾਤਕ ਫੀਨੋਟਾਈਪ C ਪ੍ਰੋਟੀਓਲਾਈਟਿਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆ-ਟਰਮੀਨਲ pp1a ਖੇਤਰ ਦੇ ਵਿਗਾੜ ਕਾਰਨ ਨਹੀਂ ਹੋਏ ਸਨ। .
ਉਪਰੋਕਤ ਡੇਟਾ ਇਸ ਗੱਲ ਦਾ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ pp1a/pp1ab ਵਿੱਚ nsp8|9 ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟ ਦੇ Mpro-ਵਿਚੋਲੇ ਇਲਾਜ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ ਨੂੰ UMPylated (ਜਾਂ ਕਿਸੇ ਹੋਰ NMP ਨਾਲ ਅੰਸ਼ਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੋਧਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, nsp9 ਦੇ N-ਟਰਮਿਨਸ (ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰ ਵਿੱਚ ਇੱਕਵਚਨ ਅਤੇ ਅਸਥਾਈ ਅਸਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸਮੇਤ) ਦੀ ਸ਼ਾਨਦਾਰ ਸੰਭਾਲ ਅਤੇ ਇਸ ਅਧਿਐਨ (ਅੰਕੜੇ 3E ਅਤੇ 5D) ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਰਿਵਰਸ ਜੈਨੇਟਿਕਸ ਡੇਟਾ ਨੇ ਸਾਨੂੰ ਇਹ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਣ ਲਈ ਅਗਵਾਈ ਕੀਤੀ ਕਿ ਵਰਣਿਤ nsp9 NMPylation. ਜੈਵਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਹੈ ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਲਈ ਜ਼ਰੂਰੀ ਹੈ।ਇਸ ਸੋਧ ਦੇ ਕਾਰਜਾਤਮਕ ਨਤੀਜਿਆਂ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਬਾਕੀ ਹੈ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਪਹਿਲਾਂ ਵਰਣਿਤ (ਗੈਰ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼) nsp9 (ਅਨਸੋਧਿਆ ਰੂਪ) RNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਗਤੀਵਿਧੀ (2628) ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ।N-ਟਰਮੀਨਲ NMPylation ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਜਾਂ RNA ਸਬਸਟਰੇਟਸ ਜਾਂ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਚਾਰ-ਪੱਧਰੀ ਅਸੈਂਬਲੀਆਂ ਦੇ ਗਠਨ ਦੇ ਨਾਲ nsp9 ਦੇ ਪਰਸਪਰ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਵੀ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਕਰ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਇਹਨਾਂ ਨੂੰ ਢਾਂਚਾਗਤ ਅਧਿਐਨਾਂ ਵਿੱਚ ਦੇਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਇਹ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਗਈ ਹੈ ਕਿ ਇਹ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਨਾਲ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਸਬੰਧਤ ਹਨ, ਹਾਲਾਂਕਿ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇਸ ਸੋਧ ਦੇ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ (26- ââ29, 40) ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ।
ਹਾਲਾਂਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਟੀਚਾ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਨੂੰ ਅਜੇ ਵੀ ਵਧੇਰੇ ਵਿਸਥਾਰ ਵਿੱਚ ਦਰਸਾਉਣ ਦੀ ਜ਼ਰੂਰਤ ਹੈ, ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੀ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਟੀਚਾ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਬਹੁਤ ਤੰਗ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ ਸਾਰੇ ਨਿਡੋਵਾਇਰਸ ਪਰਿਵਾਰਾਂ ਦੇ ਨੀਰਾਨ ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ (8, 16) ਦੀ ਸਾਂਭ-ਸੰਭਾਲ ਇਹਨਾਂ ਪ੍ਰੋਟੀਨਾਂ ਨੂੰ ਸੁਰੱਖਿਅਤ NMPylator ਦੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਦਾ ਜ਼ੋਰਦਾਰ ਸਮਰਥਨ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਇਸ ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਸਬਸਟਰੇਟ ਬਾਈਡਿੰਗ ਪਾਕੇਟ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਦੀ ਪਛਾਣ ਦੀ ਸਾਂਭ-ਸੰਭਾਲ ਅਤੇ ਸੰਭਾਲ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਹੋਣੀ ਬਾਕੀ ਹੈ। , ਅਤੇ Nidovirales ਦੇ ਉਦੇਸ਼ਾਂ ਦੇ ਵੱਖੋ-ਵੱਖਰੇ ਪਰਿਵਾਰਾਂ ਵਿਚਕਾਰ ਵੱਖ-ਵੱਖ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ।ਇਸੇ ਤਰ੍ਹਾਂ, ਹੋਰ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧਿਤ ਟੀਚੇ ਅਜੇ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੇ ਜਾਣੇ ਬਾਕੀ ਹਨ।ਉਹ nsp9 ਜਾਂ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਰਿਮੋਟ ਆਰਥੋਲੋਗ ਹੋ ਸਕਦੇ ਹਨ, ਕਿਉਂਕਿ ਪੰਜ ਰਿਪਲੀਕੇਸ ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੇ ਬਾਹਰਲੇ ਕ੍ਰਮ ਜੋ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਕੀਤੇ ਜਾਂਦੇ ਹਨ ਘੱਟ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਹੁੰਦੇ ਹਨ (8), ਜਿਸ ਵਿੱਚ Mpro ਅਤੇ NiRAN ਵਿਚਕਾਰ ਜੀਨੋਮ ਐਰੇ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ, ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ, nsp9 ਵਿੱਚ ਸਥਿਤ ਹੈ। ਕੋਰੋਨਾ ਵਾਇਰਸ.
ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਅਸੀਂ ਵਰਤਮਾਨ ਵਿੱਚ ਇਸ ਸੰਭਾਵਨਾ ਤੋਂ ਇਨਕਾਰ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦੇ ਕਿ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਵਿੱਚ ਵਾਧੂ (ਸੈਲੂਲਰ ਸਮੇਤ) ਟੀਚੇ ਹਨ।ਇਸ ਮਾਮਲੇ ਵਿੱਚ, ਇਹ ਵਰਣਨ ਯੋਗ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਉੱਭਰ ਰਹੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ NMPylators (NMPylators) (30, 31) ਵਿੱਚ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਸਮਰੂਪ "ਮਾਸਟਰ ਰੈਗੂਲੇਟਰ" ਹਨ?NMP ਉਹਨਾਂ ਦੀਆਂ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕਰਨ ਜਾਂ ਖ਼ਤਮ ਕਰਨ ਲਈ ਕਈ ਕਿਸਮ ਦੇ ਸੈਲੂਲਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਮੋਡਿਊਲੇਟ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਕਈ ਤਰ੍ਹਾਂ ਦੀਆਂ ਜੀਵ-ਵਿਗਿਆਨਕ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਵਿੱਚ ਭੂਮਿਕਾ ਨਿਭਾਉਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਸੈਲੂਲਰ ਤਣਾਅ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਅਤੇ ਰੈਡੌਕਸ ਹੋਮਿਓਸਟੈਸਿਸ (22, 33).
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ (ਅੰਕੜੇ 2 ਅਤੇ 4 ਅਤੇ SI ਅੰਤਿਕਾ, ਅੰਕੜੇ S3 ਅਤੇ S5), ਅਸੀਂ ਇਹ ਸਾਬਤ ਕਰਨ ਦੇ ਯੋਗ ਸੀ ਕਿ nsp12 ਨੇ UMP (NMP) ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ nsp9 ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਸਿੰਗਲ (ਸੰਰੱਖਿਤ) ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਤਬਦੀਲ ਕਰ ਦਿੱਤਾ, ਜਦੋਂ ਕਿ ਹੋਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਵਿੱਚ ਸੋਧ ਨਹੀਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ। ਸ਼ਰਤਾਂ ਅਧੀਨ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਚੰਗੀ ਤਰ੍ਹਾਂ ਪਰਿਭਾਸ਼ਿਤ (ਢਿੱਲੀ ਦੀ ਬਜਾਏ) ਸਬਸਟਰੇਟ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਸਮਰਥਿਤ ਹੈ।ਇਸਦੇ ਨਾਲ ਇਕਸਾਰ, N-ਟਰਮੀਨਲ nsp9 NMPylation ਦੇ ਮੁਕਾਬਲੇ, nsp12 ਦੀ ਆਪਣੀ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਬਹੁਤ ਘੱਟ ਹੈ, ਇਸਦੀ ਖੋਜ ਲਈ ਲੰਬੇ ਆਟੋਰੇਡੀਓਗ੍ਰਾਫੀ ਐਕਸਪੋਜ਼ਰ ਸਮੇਂ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਅਤੇ nsp12 ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ 10-ਗੁਣਾ ਵਾਧਾ ਵਰਤਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸਾਡਾ MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ nsp12 ਦੇ NMPylation ਲਈ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਨ ਵਿੱਚ ਅਸਫਲ ਰਿਹਾ, ਜੋ ਸੁਝਾਅ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਕਿ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਸਵੈ-NMPylation (ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ) ਇੱਕ ਸੈਕੰਡਰੀ ਗਤੀਵਿਧੀ ਹੈ।ਹਾਲਾਂਕਿ, ਇਹ ਨੋਟ ਕੀਤਾ ਜਾਣਾ ਚਾਹੀਦਾ ਹੈ ਕਿ ਹੋਰ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨੇ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਹਨ ਕਿ ਬੈਕਟੀਰੀਆ NMPylator ਦੀ ਸਵੈ-AMPylation ਸਥਿਤੀ ਦੂਜੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਬਸਟਰੇਟਾਂ (22, 33) 'ਤੇ ਉਨ੍ਹਾਂ ਦੀ NMPylation ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਨਿਯੰਤਰਿਤ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਲਈ, ਈਏਵੀ nsp9 (16) ਅਤੇ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ nsp12 (ਇਸ ਅਧਿਐਨ) ਲਈ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੇ ਗਏ ਸਵੈ-ਐਨਐਮਪੀਲੇਸ਼ਨ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਦੇ ਸੰਭਾਵੀ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰਭਾਵਾਂ ਦੀ ਜਾਂਚ ਕਰਨ ਲਈ ਹੋਰ ਖੋਜ ਦੀ ਲੋੜ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ RdRp ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਫੋਲਡਿੰਗ 'ਤੇ ਪ੍ਰਸਤਾਵਿਤ ਚੈਪਰੋਨ-ਵਰਗੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਸ਼ਾਮਲ ਹਨ। 16)).
ਪਹਿਲਾਂ, nidoviral NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਸੰਭਾਵਿਤ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਸੰਬੰਧ ਵਿੱਚ ਕਈ ਅਨੁਮਾਨਾਂ 'ਤੇ ਵਿਚਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ RNA ligase, RNA-ਕੈਪਡ ਗੁਆਨੀਲੇਟ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰੇਜ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਾਈਮਿੰਗ ਗਤੀਵਿਧੀ (16), ਪਰ ਇਹਨਾਂ ਵਿੱਚੋਂ ਕੋਈ ਵੀ ਉਪਲਬਧ ਡਾਊਨਸਟ੍ਰੀਮ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਦੇ ਅਨੁਕੂਲ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਨਿਮਨਲਿਖਤ ਅਹੁਦਿਆਂ 'ਤੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕੀਤੀ ਜਾਣਕਾਰੀ ਵਾਧੂ ਧਾਰਨਾਵਾਂ ਬਣਾਏ ਬਿਨਾਂ ਬਿਲਕੁਲ ਉਸੇ ਸਮੇਂ ਦੀ ਹੈ।ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰਾਪਤ ਡੇਟਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਧ ਅਨੁਕੂਲ ਹੈ (ਪਰ ਇਹ ਸਾਬਤ ਨਹੀਂ ਕਰ ਸਕਦਾ) ਕਿ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ RNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਹੈ।ਇਹ ਪਹਿਲਾਂ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਸੀ ਕਿ 5 ਵਿੱਚ ਨੀਰਨ ਡੋਮੇਨ ਦਾ ਕੰਮ?²-ਆਰਐਨਏ ਕੈਪਿੰਗ ਜਾਂ ਆਰਐਨਏ ਲਿਗੇਸ਼ਨ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆਵਾਂ ਇਹਨਾਂ ਅਤੇ ਹੋਰ ਡੇਟਾ ਦੇ ਸਮਰਥਨ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀਆਂ ਹਨ।ਇਸਲਈ, ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, NiRAN ਦੀ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਨੂੰ ਇੱਕ ਆਮ ਅਧਾਰ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਏਐਸਪੀ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਲਈ ਮੰਨਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ (ਸੂਡੋਮੋਨਾਸ syringae SelO ਵਿੱਚ D252; HCoV-229E pp1ab ਵਿੱਚ D4271; SARS-CoV-2 nsp12 ਵਿੱਚ D208) (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਚਿੱਤਰ 2 ).S2) (17, 22, 33), ਜਦੋਂ ਕਿ ਏਟੀਪੀ-ਨਿਰਭਰ ਆਰਐਨਏ ਲਿਗੇਸ ਅਤੇ ਆਰਐਨਏ ਕੈਪਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਵਿੱਚ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਕੋਵਲੈਂਟ ਐਂਜ਼ਾਈਮ-(ਲਾਈਸਿਲ-ਐਨ)-ਐਨਐਮਪੀ ਇੰਟਰਮੀਡੀਏਟ ਦੁਆਰਾ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਗੈਰ-ਬਦਲਿਆ ਹੋਇਆ ਲਾਈਸ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ( 41)।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਟੀਚਿਆਂ ਲਈ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ NiRAN ਦੀ ਕਮਾਲ ਦੀ ਕ੍ਰਮ-ਅਧਾਰਿਤ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ ਅਤੇ NTP ਸਹਿ-ਸਬਸਟ੍ਰੇਟਸ (UTP ਨੂੰ ਤਰਜੀਹ ਦਿੰਦਾ ਹੈ) ਲਈ ਅਰਾਮਦਾਇਕ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾ NiRAN-ਵਿਚੋਲੇ ਕੈਪਿੰਗ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਜਾਂ RNA ligase-ਵਰਗੇ ਫੰਕਸ਼ਨਾਂ ਦਾ ਵਿਰੋਧ ਕਰਦੀ ਹੈ।
ਸਪੱਸ਼ਟ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਤਸਦੀਕ ਕਰਨ ਲਈ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਵਾਧੂ ਕੰਮ ਦੀ ਲੋੜ ਹੁੰਦੀ ਹੈ ਅਤੇ, ਜੇ ਸਾਬਤ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਆਰਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ nsp9-UMP (nsp9-NMP) ਦੀ ਸੰਭਾਵੀ ਭੂਮਿਕਾ ਬਾਰੇ ਵਿਸਤ੍ਰਿਤ, ਜੋ ਕਿ ਕਈ ਦਿਲਚਸਪ ਪਰ (ਹੁਣ ਤੱਕ) ਪਹਿਲਾਂ ਰਿਪੋਰਟ ਕੀਤੀਆਂ ਰਿਪੋਰਟਾਂ ਨੂੰ ਜੋੜਨਗੇ। .ਅਲੱਗ-ਥਲੱਗ ਨਿਰੀਖਣ।ਉਦਾਹਰਨ ਲਈ, ਇਹ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦੇ ਨੈਗੇਟਿਵ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਆਰਐਨਏ ਦਾ ਅੰਤ ਇੱਕ ਓਲੀਗੋ (ਯੂ) ਸਟ੍ਰੈਂਡ (42, 43) ਨਾਲ ਸ਼ੁਰੂ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਹ ਨਿਰੀਖਣ ਇਸ ਵਿਚਾਰ ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਨੈਗੇਟਿਵ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ RNA ਦਾ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ nsp9 ਦੇ UMPylated ਫਾਰਮ ਨੂੰ ਪੌਲੀ(A) ਟੇਲ (ਟਰਿਗਰਜ਼) ਨਾਲ ਜੋੜ ਕੇ ਸ਼ੁਰੂ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਇਸਦੀ RNA ਬਾਈਡਿੰਗ ਦੁਆਰਾ ਅੱਗੇ ਵਧਾਇਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ/ਜਾਂ ਨਾਲ ਪਰਸਪਰ ਕਿਰਿਆ ਹੈ। ਇੱਕ ਹੋਰ RTC ਪ੍ਰੋਟੀਨ.nsp9 ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕੀਤੇ ਗਏ UMP ਹਿੱਸੇ ਨੂੰ ਫਿਰ nsp7/8/nsp12-ਵਿਚੋਲੇ oligouridylation ਲਈ "ਪ੍ਰਾਈਮਰ" ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੀਨੋਮਿਕ RNA ਵਿੱਚ 3??²-ਪੌਲੀ(A) ਟੇਲ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜਾਂ ਇੱਕ ਹੋਰ ਓਲੀਗੋ (A) ਵਾਲੇ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਜਾ ਸਕਦੀ ਹੈ। ਪਿਕੋਰਨਵਾਇਰਸ VPg ਪ੍ਰੋਟੀਨ (44) ਲਈ ਸਥਾਪਿਤ ਵਿਧੀ ਦੇ ਸਮਾਨ ਇੱਕ ਟੈਂਪਲੇਟ ਦੇ ਤੌਰ ਤੇ ਕੰਮ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਜੇ ਪ੍ਰਸਤਾਵ "ਗੈਰ-ਆਧਾਰਨ" ਹੈ ਤਾਂ ਕੀ ਹੋਵੇਗਾ????(ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ) ਨੈਗੇਟਿਵ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਆਰਐਨਏ ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਲਿੰਕ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦੀ ਹੈ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦੀ ਹੈ ਕਿ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਨੈਗੇਟਿਵ-ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਆਰਐਨਏ ਦੇ ਅੰਤ (42) ਵਿੱਚ UMP (UTP ਦੀ ਬਜਾਏ) ਹੈ, ਜੋ ਇਹ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਡਾਈਸਰ ਇੱਕ ਅਣਜਾਣ ਯੂਰੀਡੀਨ-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਐਂਡੋਨਿਊਕਲੀਜ਼ ਦੁਆਰਾ ਅੰਤਮ ਫਾਸਫੋਰੀਲੇਟਡ ਨੂੰ ਕਲੀਵ ਕਰਦਾ ਹੈ।ਜੇਕਰ ਪੁਸ਼ਟੀ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਇਹ ਨਿਊਕਲੀਕ ਐਸਿਡ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲਾਈਟਿਕ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੈਸੈਂਟ ਨੈਗੇਟਿਵ ਸਟ੍ਰੈਂਡ ਦੇ 5 ² ਸਿਰੇ ਤੋਂ nsp9 ਦੇ oligomeric UMPylated ਰੂਪ ਨੂੰ ਛੱਡਣ ਵਿੱਚ ਮਦਦ ਕਰ ਸਕਦੀ ਹੈ।ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਾਈਮਿੰਗ ਵਿੱਚ nsp9 ਦੀ ਸੰਭਾਵਿਤ ਭੂਮਿਕਾ ਪਿਛਲੇ ਰਿਵਰਸ ਜੈਨੇਟਿਕਸ ਅਧਿਐਨਾਂ ਨਾਲ ਵੀ ਮੇਲ ਖਾਂਦੀ ਹੈ, ਜਿਸ ਨੇ ਦਿਖਾਇਆ ਹੈ ਕਿ nsp9 (ਅਤੇ nsp8) ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਜੀਨੋਮ ਦੇ 3 ਸਿਰੇ ਦੇ ਨੇੜੇ ਸੁਰੱਖਿਅਤ ਸੀਆਈਐਸ-ਐਕਟਿੰਗ ਆਰਐਨਏ ਤੱਤ ਦੇ ਨਾਲ ਗੰਭੀਰ ਅਤੇ ਖਾਸ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਟਰੈਕਟ ਕਰਦੇ ਹਨ।45)।ਇਸ ਰਿਪੋਰਟ ਦੇ ਅਨੁਸਾਰ, ਇਹਨਾਂ ਪਿਛਲੇ ਨਿਰੀਖਣਾਂ ਨੂੰ ਹੁਣ ਦੁਬਾਰਾ ਜਾਂਚਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਹੋਰ ਖੋਜ ਦੁਆਰਾ ਵਿਸਤਾਰ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।
ਸੰਖੇਪ ਵਿੱਚ, ਸਾਡੇ ਡੇਟਾ ਨੇ N-ਟਰਮਿਨਸ 'ਤੇ RdRp ਨਾਲ ਜੁੜੇ ਇੱਕ ਮਲਕੀਅਤ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸ ਐਂਜ਼ਾਈਮ ਟੈਗ ਦੀ ਖਾਸ ਗਤੀਵਿਧੀ ਨੂੰ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤਾ ਹੈ।ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਵਿੱਚ, ਇਸ ਨਵੀਂ ਖੋਜੀ ਗਈ NiRAN-ਵਿਚੋਲਗੀ ਵਾਲੇ UMPylator/NMPylator ਗਤੀਵਿਧੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ Mn2+ ਅਤੇ ਆਸ ਪਾਸ ਦੇ ਆਸਨ ਰਹਿੰਦ-ਖੂੰਹਦ 'ਤੇ ਭਰੋਸਾ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਜਾਂਦੀ ਹੈ ਅਤੇ N-ਟਰਮੀਨਲ ਪ੍ਰਾਇਮਰੀ ਅਮੀਨ ਨਾਲ (ਘੱਟ-ਊਰਜਾ) ਫਾਸਫੋਰਾਮੀਡੇਟ ਬਾਂਡਾਂ ਦੇ ਗਠਨ ਦਾ ਕਾਰਨ ਬਣਦੀ ਹੈ।nsp8|9 ਕਲੀਵੇਜ ਸਾਈਟ 'ਤੇ Mpro-ਮੀਡੀਏਟਿਡ ਕਲੀਵੇਜ ਦੁਆਰਾ, nsp9 ਟੀਚੇ ਨੂੰ NMPylation ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਜ਼ ਅਤੇ NiRAN ਡੋਮੇਨ ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ ਕਾਰਜਸ਼ੀਲ ਜੋੜ ਨੂੰ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ RdRp ਤੱਕ ਫੈਲਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ।nsp12 NiRAN ਐਕਟਿਵ ਸਾਈਟ ਅਤੇ nsp9 ਟਾਰਗੇਟ ਵਿੱਚ ਮੁੱਖ ਅਵਸ਼ੇਸ਼ਾਂ ਦੀ ਸੰਭਾਲ, SARS-CoV-2 ਸਮੇਤ ਦੋ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਤੋਂ ਪ੍ਰਾਪਤ ਡੇਟਾ ਦੇ ਨਾਲ ਮਿਲਾ ਕੇ, ਇਸ ਗੱਲ ਦਾ ਪੱਕਾ ਸਬੂਤ ਪ੍ਰਦਾਨ ਕਰਦਾ ਹੈ ਕਿ nsp9 NMPylation ਇੱਕ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਹੈ ਕੰਜ਼ਰਵੇਟਿਵ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ਤਾਵਾਂ ਵੀ ਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਤੀ ਵਿੱਚ ਇੱਕ ਮੁੱਖ ਕਦਮ ਹਨ।ਉਪਲਬਧ ਅੰਕੜੇ ਸਾਨੂੰ ਇਹ ਸਿੱਟਾ ਕੱਢਣ ਲਈ ਅਗਵਾਈ ਕਰਦੇ ਹਨ ਕਿ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਪ੍ਰੇਰਿਤ RNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ nsp9 ਦੇ NMPylated ਰੂਪ ਦੀ ਵਿਸ਼ੇਸ਼ ਭੂਮਿਕਾ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਅਤੇ ਹੋਰ ਨੇਸਟਡ ਵਾਇਰਸਾਂ ਲਈ ਇੱਕ ਉਚਿਤ ਦ੍ਰਿਸ਼ ਹੈ, ਅਤੇ NiRAN ਹੋਰ ਅਣਪਛਾਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਵੀ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਵਾਇਰਸ ਨੂੰ ਨਿਯਮਤ ਕਰੋ.ਹੋਸਟ ਪਰਸਪਰ ਕ੍ਰਿਆ.ਜੇਕਰ ਪੁਸ਼ਟੀ ਹੋ ਜਾਂਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਵਾਇਰਲ RNA ਸੰਸਲੇਸ਼ਣ ਵਿੱਚ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਾਈਮਰਾਂ ਦੀ ਸ਼ਮੂਲੀਅਤ ਪਹਿਲਾਂ ਖੋਜੇ ਗਏ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਅਤੇ ਪਿਕੋਰਨਾਵਾਇਰਸ-ਵਰਗੇ ਸੁਪਰਗਰੁੱਪ (9) ਦੇ ਵਿਚਕਾਰ Mpro/3CLpro ਅਤੇ RdRp ਡੋਮੇਨਾਂ ਦੀ ਕ੍ਰਮ ਸਾਂਝ ਨੂੰ ਵਧਾਏਗੀ, ਜੋ ਹੁਣ ਹਾਲ ਹੀ ਵਿੱਚ ਸਥਾਪਿਤ ਕੀਤੇ ਗਏ Pisonivirites (9) ਵਿੱਚ ਏਕੀਕ੍ਰਿਤ ਹਨ। 46) ਸ਼੍ਰੇਣੀ ਵਿੱਚ.
ਸਾਡਾ ਡੇਟਾ ਇਹ ਵੀ ਦਰਸਾਉਂਦਾ ਹੈ ਕਿ ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪਛਾਣੀਆਂ ਗਈਆਂ ਬੁਨਿਆਦੀ, ਚੋਣਵੇਂ ਅਤੇ ਰੂੜ੍ਹੀਵਾਦੀ ਐਨਜ਼ਾਈਮ ਗਤੀਵਿਧੀਆਂ ਨੂੰ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ ਦਵਾਈਆਂ ਲਈ ਟੀਚੇ ਵਜੋਂ ਵਰਤਿਆ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ।ਉਹ ਮਿਸ਼ਰਣ ਜੋ NiRAN ਦੀ ਸਰਗਰਮ ਸਾਈਟ ਵਿੱਚ ਸੁਰੱਖਿਅਤ nsp9 N-ਟਰਮਿਨਸ ਦੇ ਬਾਈਡਿੰਗ (ਅਤੇ ਬਾਅਦ ਵਿੱਚ ਸੋਧ) ਵਿੱਚ ਦਖਲ ਦਿੰਦੇ ਹਨ, ਨੂੰ ਪ੍ਰਭਾਵੀ ਅਤੇ ਬਹੁਮੁਖੀ ਐਂਟੀਵਾਇਰਲ ਦਵਾਈਆਂ ਵਿੱਚ ਵਿਕਸਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਵੱਖ-ਵੱਖ (ਉਪ) ਜੀਨਸ ਦੇ ਜਾਨਵਰਾਂ ਅਤੇ ਮਨੁੱਖੀ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਦੇ ਇਲਾਜ ਲਈ ਢੁਕਵੀਂ ਹੈ। , SARS-CoV-2 ਅਤੇ ਮਿਡਲ ਈਸਟ ਰੈਸਪੀਰੇਟਰੀ ਸਿੰਡਰੋਮ ਕੋਰੋਨਾਵਾਇਰਸ ਸਮੇਤ।
ਇਸ ਅਧਿਐਨ ਵਿੱਚ ਪੈਦਾ ਹੋਏ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਕੋਡਿੰਗ ਕ੍ਰਮ ਨੂੰ RT-PCR ਦੁਆਰਾ HCoV-229E ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ Huh-7 ਜਾਂ SARS-CoV-2 ਨਾਲ ਸੰਕਰਮਿਤ ਵੇਰੋ E6 ਤੋਂ ਅਲੱਗ RNA ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਵਧਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਮਿਆਰੀ ਕਲੋਨਿੰਗ ਪ੍ਰਕਿਰਿਆਵਾਂ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਸੰਮਿਲਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।pMAL-c2 (ਨਿਊ ਇੰਗਲੈਂਡ ਜੈਵਿਕ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ) ਜਾਂ PASK3-Ub-CHis6 (47) ਸਮੀਕਰਨ ਵੈਕਟਰ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1 ਅਤੇ S2)।ਸਿੰਗਲ ਕੋਡੋਨ ਬਦਲ ਨੂੰ ਪੀਸੀਆਰ-ਅਧਾਰਿਤ ਸਾਈਟ-ਨਿਰਦੇਸ਼ਿਤ ਮਿਊਟਾਜੇਨੇਸਿਸ (48) ਦੁਆਰਾ ਪੇਸ਼ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।MBP ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ, E. coli TB1 ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਉਚਿਤ pMAL-c2 ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਕੰਸਟਰੱਕਟ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1) ਨਾਲ ਬਦਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਐਮੀਲੋਜ਼ ਐਫੀਨਿਟੀ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਫੈਕਟਰ Xa ਨਾਲ ਕਲੀਵ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਸ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਹਿਸ6-ਟੈਗਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਨੀ-ਇਮੋਬਿਲਾਈਜ਼ਡ ਮੈਟਲ ਐਫੀਨਿਟੀ ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫੀ (Ni-IMAC) ਦੁਆਰਾ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (49)।ubiquitin ਫਿਊਜ਼ਨ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪੈਦਾ ਕਰਨ ਲਈ, E. coli TB1 ਸੈੱਲਾਂ ਨੇ ਉਚਿਤ pASK3-Ub-CHis6 ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਕੰਸਟਰੱਕਟ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1 ਅਤੇ S2) ਅਤੇ pCGI ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਡੀਐਨਏ ਇੰਕੋਡਿੰਗ ubiquitin-ਵਿਸ਼ੇਸ਼ C-ਟਰਮੀਨਲ ਹਾਈਡ੍ਰੋਲੇਸ 1 (Ubp1) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ।ਪਰਿਵਰਤਨ (47)।ਸੀ-ਟਰਮੀਨਲ ਹਿਸ6-ਟੈਗਡ ਕੋਰੋਨਵਾਇਰਸ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਸ਼ੁੱਧ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪਹਿਲਾਂ ਦੱਸਿਆ ਗਿਆ ਸੀ (50).
HCoV-229E nsp12-His6 ਦਾ ਸਵੈ-NMPylation ਟੈਸਟ EAV nsp9 (16) ਵਿੱਚ ਵਰਣਨ ਕੀਤੇ ਅਨੁਸਾਰ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਸੰਖੇਪ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, nsp12-His6 (0.5 µM) ਵਿੱਚ 50 mM 4-(2-ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਥਾਈਲ)-1-ਪਾਈਪਰਾਜ਼ਿਨੇਥੇਨੇਸੁਲਫੋਨਿਕ ਐਸਿਡ (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, buffer, 25 ਐੱਮ.ਐੱਮ. ਨਿਰਧਾਰਤ NTP ਅਤੇ 0.17 µM 30 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 30 °C 'ਤੇ [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; ਹਾਰਟਮੈਨ ਐਨਾਲਿਟਿਕ) ਨਾਲ ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ ਹੈ।nsp12-ਵਿਚੋਲੇ nsp9 NMPylation ਦੇ ਹੋਰ ਸਾਰੇ (ਸਟੈਂਡਰਡ) NMPylation ਅਸੈਸਾਂ ਵਿੱਚ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੀਆਂ ਸਥਿਤੀਆਂ ਨੂੰ ਇਸ ਤਰ੍ਹਾਂ ਐਡਜਸਟ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ: nsp12-His6 (0.05 µM) ਅਤੇ nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH08) ਦੀ ਮੌਜੂਦਗੀ ਵਿੱਚ। ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM ਸੰਕੇਤ NTP, ਅਤੇ 0.17 µM ਮੇਲ ਖਾਂਦਾ [α32-P]NTP।30 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ 10 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਪ੍ਰਤੀਕ੍ਰਿਆ ਦੇ ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ SDS-PAGE ਨਮੂਨਾ ਬਫਰ ਨਾਲ ਮਿਲਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ: 62.5 mM ਟ੍ਰਿਸ (ਹਾਈਡ੍ਰੋਕਸਾਈਮਾਈਥਾਈਲ) ਐਮੀਨੋਮੇਥੇਨ HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% ਗਲਾਈਸਰੋਲ ਅਤੇ 0.005% ਨੀਲਾਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ 5 ਮਿੰਟ ਲਈ 90 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ ਤੇ ਗਰਮ ਕਰਕੇ ਅਤੇ 12% SDS-PAGE ਦੁਆਰਾ ਵੱਖ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਜੈੱਲ ਨੂੰ ਕੂਮਾਸੀ ਬ੍ਰਿਲਿਅੰਟ ਬਲੂ ਘੋਲ (40% ਮੀਥੇਨੌਲ, 10% ਐਸੀਟਿਕ ਐਸਿਡ, 0.05% ਕੂਮੈਸੀ ਬ੍ਰਿਲਿਅੰਟ ਬਲੂ R-250) ਨਾਲ ਫਿਕਸ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਹੈ ਅਤੇ ਰੰਗਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਅਤੇ 20 ਘੰਟਿਆਂ ਲਈ ਫਾਸਫੋਰਸੈਂਟ ਇਮੇਜਿੰਗ ਸਕ੍ਰੀਨ ਦੇ ਸਾਹਮਣੇ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ (NMPy ਤੋਂ nsp12 ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਉਣ ਲਈ) ਜਾਂ (ਵੱਧ ਤੋਂ ਵੱਧ) 2 ਘੰਟੇ (nsp9 NMPylation ਦਾ ਮੁਲਾਂਕਣ ਕਰਨ ਲਈ)।ਇੱਕ ਟਾਈਫੂਨ 9200 ਇਮੇਜਰ (GE ਹੈਲਥਕੇਅਰ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸਕ੍ਰੀਨ ਨੂੰ ਸਕੈਨ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ ਇਮੇਜਜੇ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਸਿਗਨਲ ਦੀ ਤੀਬਰਤਾ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।
MS ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਲਈ, 1 µM nsp12-His6 ਅਤੇ 10 µM nsp9 (ਹੈਕਸਾਹਿਸਟੀਡਾਈਨ ਟੈਗ ਤੋਂ ਬਿਨਾਂ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ NMPylation ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ (SI ਅੰਤਿਕਾ, ਟੇਬਲ S1) ਵਿੱਚ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ ਅਤੇ 500 µM UTP ਅਤੇ GTP ਦੀ ਵਧੀ ਹੋਈ ਇਕਾਗਰਤਾ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਉਹਨਾਂ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਤੇ ਅਨੁਮਾਨਤ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਗੁਣਵੱਤਾ 'ਤੇ ਨਿਰਭਰ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਮਾਸਪ੍ਰੈਪ ਕਾਲਮ (ਵਾਟਰਸ) ਨਾਲ ਲੈਸ ਵਾਟਰਸ ਐਕਵਿਟੀ ਐਚ-ਕਲਾਸ HPLC ਸਿਸਟਮ ਨੂੰ 1 ਤੋਂ 10 μL ਬਫਰ ਕੀਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੱਲਾਂ ਨੂੰ ਔਨਲਾਈਨ ਡੀਸਾਲਟ ਕਰਨ ਲਈ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਬਫਰ A (ਪਾਣੀ/0.05% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਅਤੇ ਬਫਰ ਬੀ (ਐਸੀਟੋਨਿਟ੍ਰਾਈਲ/0.045% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ) ਦੇ ਹੇਠਾਂ ਦਿੱਤੇ ਗਰੇਡੀਐਂਟ ਦੁਆਰਾ ਸਿਨੈਪਟ G2Si ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਪਾਣੀ) ਦੇ ਇਲੈਕਟ੍ਰੋਸਪ੍ਰੇ ਆਇਨ ਸ੍ਰੋਤ ਵਿੱਚ ਡੀਸਲਟਿਡ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਅਲੋਪ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਅਤੇ ਕਾਲਮ ਦਾ ਤਾਪਮਾਨ ਹੁੰਦਾ ਹੈ। 60 ° C ਅਤੇ 0.1 mL/min ਦੀ ਵਹਾਅ ਦਰ: 2 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 5% A ਦੇ ਨਾਲ ਈਲੂਸ਼ਨ, ਫਿਰ 8 ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ 95% B ਤੱਕ ਇੱਕ ਰੇਖਿਕ ਗਰੇਡੀਐਂਟ, ਅਤੇ ਹੋਰ 4 ਮਿੰਟਾਂ ਲਈ 95% B ਨੂੰ ਬਰਕਰਾਰ ਰੱਖੋ।
500 ਤੋਂ 5000 m/z ਦੀ ਪੁੰਜ ਰੇਂਜ ਵਾਲੇ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਆਇਨਾਂ ਦਾ ਪਤਾ ਲਗਾਇਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਗਲੂ-ਫਾਈਬਰੀਨੋਪੇਪਟਾਇਡ ਬੀ ਨੂੰ ਆਟੋਮੈਟਿਕ ਪੁੰਜ ਡ੍ਰਾਈਫਟ ਸੁਧਾਰ ਲਈ ਹਰ 45 ਸਕਿੰਟਾਂ ਵਿੱਚ ਮਾਪਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।ਬੇਸਲਾਈਨ ਅਤੇ ਸਮੂਥਿੰਗ ਨੂੰ ਕੱਟਣ ਤੋਂ ਬਾਅਦ ਔਸਤ ਸਪੈਕਟ੍ਰਮ ਨੂੰ ਡੀਕਨਵੋਲ ਕਰਨ ਲਈ MaxEnt1 ਐਕਸਟੈਂਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ MassLynx ਇੰਸਟਰੂਮੈਂਟ ਸੌਫਟਵੇਅਰ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰੋ।
UMPylated HCoV-229E nsp9 ਨੂੰ ਸੀਕੁਏਂਸਿੰਗ-ਗ੍ਰੇਡ ਮੋਡੀਫਾਈਡ ਟ੍ਰਾਈਪਸਿਨ (ਸਰਵਾ) ਜੋੜ ਕੇ ਹਜ਼ਮ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਰਾਤ ਨੂੰ 37 ਡਿਗਰੀ ਸੈਲਸੀਅਸ 'ਤੇ ਪ੍ਰਫੁੱਲਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਇੱਕ Chromabond C18WP ਸਪਿੱਨ ਕਾਲਮ (ਭਾਗ ਨੰਬਰ 730522; ਮਾਚੇਰੀ-ਨਾਗੇਲ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਪੇਪਟਾਇਡਾਂ ਨੂੰ ਡੀਸਾਲਟ ਕਰਨ ਅਤੇ ਕੇਂਦਰਿਤ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ।ਅੰਤ ਵਿੱਚ, ਪੇਪਟਾਇਡ ਨੂੰ 25 µL ਪਾਣੀ ਵਿੱਚ ਘੋਲ ਦਿੱਤਾ ਗਿਆ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ 5% ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ ਅਤੇ 0.1% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਸੀ।
MS ਦੁਆਰਾ ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਵੇਲੋਸ ਪ੍ਰੋ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ (ਥਰਮੋ ਸਾਇੰਟਿਫਿਕ) ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਕੇ ਨਮੂਨਿਆਂ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਅੰਤਮ ਨੈਨੋ HPLC ਸਿਸਟਮ (Dionex), ਇੱਕ ਕਸਟਮ ਐਂਡ-ਮਾਊਂਟਡ 50 ਸੈਂਟੀਮੀਟਰ ਨਾਲ ਲੈਸ??2.4 μm ਚੁੰਬਕੀ ਮਣਕਿਆਂ ਨਾਲ ਪੈਕ 75 μm C18 RP ਕਾਲਮ (ਡਾ. ਐਲਬਿਨ ਮਾਈਸ਼ ਹਾਈ ਪਰਫਾਰਮੈਂਸ LC GmbH) ਪ੍ਰੋਕਸੀਓਨ ਨੈਨੋਸਪ੍ਰੇ ਸਰੋਤ ਦੁਆਰਾ ਔਨਲਾਈਨ ਮਾਸ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਨਾਲ ਜੁੜੋ;300 µm ਅੰਦਰਲੇ ਵਿਆਸ ×??1 cm C18 PepMap ਪੂਰਵ-ਇਕਾਗਰਤਾ ਕਾਲਮ (ਥਰਮੋ ਵਿਗਿਆਨਕ)।ਘੋਲਨ ਵਾਲੇ ਦੇ ਤੌਰ 'ਤੇ ਪਾਣੀ/0.05% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਨਮੂਨੇ ਨੂੰ 6 µL/ਮਿੰਟ ਦੀ ਵਹਾਅ ਦਰ 'ਤੇ ਆਪਣੇ ਆਪ ਫਸਾਇਆ ਗਿਆ ਅਤੇ ਡੀਸੈਲਿਨੇਟ ਕੀਤਾ ਗਿਆ।
ਪਾਣੀ/0.05% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ (ਸਾਲਵੈਂਟ ਏ) ਅਤੇ 80% ਐਸੀਟੋਨਾਈਟ੍ਰਾਈਲ/0.045% ਫਾਰਮਿਕ ਐਸਿਡ (ਘੋਲਨ ਵਾਲਾ ਬੀ) ਦੇ ਹੇਠਲੇ ਗਰੇਡੀਐਂਟਸ ਦੀ ਵਰਤੋਂ 300 nL/ਮਿੰਟ ਦੀ ਵਹਾਅ ਦਰ 'ਤੇ ਟ੍ਰਿਪਟਿਕ ਪੇਪਟਾਇਡਸ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਲਈ ਕੀਤੀ ਗਈ ਸੀ: 4% ਬੀ ਲਈ 5 ਮਿੰਟ, ਫਿਰ ਮਿੰਟਾਂ ਦੇ ਅੰਦਰ 45% B ਤੱਕ 30 A ਲੀਨੀਅਰ ਗਰੇਡੀਐਂਟ, ਅਤੇ 5 ਮਿੰਟ ਦੇ ਅੰਦਰ 95% ਘੋਲਨ ਵਾਲਾ B ਤੱਕ ਇੱਕ ਰੇਖਿਕ ਵਾਧਾ।ਕ੍ਰੋਮੈਟੋਗ੍ਰਾਫਿਕ ਕਾਲਮ ਨੂੰ ਇੱਕ ਸਟੇਨਲੈਸ ਸਟੀਲ ਨੈਨੋ-ਇਮੀਟਰ (ਪ੍ਰੌਕਸੀਓਨ) ਨਾਲ ਕਨੈਕਟ ਕਰੋ, ਅਤੇ 2,300 V ਦੀ ਸੰਭਾਵੀ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਪੁੰਜ ਸਪੈਕਟਰੋਮੀਟਰ ਦੀ ਗਰਮ ਕੇਸ਼ਿਕਾ ਵਿੱਚ ਸਿੱਧੇ ਈਲੂਐਂਟ ਨੂੰ ਸਪਰੇਅ ਕਰੋ। ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਮਾਸ ਐਨਾਲਾਈਜ਼ਰ ਵਿੱਚ 60,000 ਦੇ ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ ਨਾਲ ਸਰਵੇਖਣ ਸਕੈਨ ਜੁੜਿਆ ਹੋਇਆ ਹੈ। ਘੱਟ ਤੋਂ ਘੱਟ ਤਿੰਨ ਡਾਟਾ MS/MS ਸਕੈਨਾਂ ਦੇ ਨਾਲ, 30 ਸਕਿੰਟਾਂ ਲਈ ਗਤੀਸ਼ੀਲ ਤੌਰ 'ਤੇ ਬਾਹਰ ਰੱਖਿਆ ਗਿਆ ਹੈ, ਰੇਖਿਕ ਆਇਨ ਟਰੈਪ ਟੱਕਰ ਇੰਡਿਊਸਡ ਡਿਸਸੋਸੀਏਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ ਜਾਂ ਔਰਬਿਟਰੈਪ ਡਿਟੈਕਸ਼ਨ ਦੇ ਨਾਲ ਉੱਚ ਊਰਜਾ ਟੱਕਰ ਡਿਸਸੋਸਿਏਸ਼ਨ ਦੀ ਵਰਤੋਂ ਕਰਦੇ ਹੋਏ, ਰੈਜ਼ੋਲਿਊਸ਼ਨ 7,500 ਹੈ।
ਪੋਸਟ ਟਾਈਮ: ਅਗਸਤ-03-2021